地骨皮提取液对2型糖尿病大鼠肾脏COX-2表达的影响

杨 珺 浙江省中医院 杭州 310006

糖尿病（diabetes mellitus，DM）特别是 2型糖尿病患病率逐年升高[1]，已成为威胁人类健康的重大社会问题。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是DM常见并发症之一。研究表明，环氧化酶-2（COX-2）在DN发生发展中可能起重要作用[2]。地骨皮是茄科植物枸杞（Lycium chinese Mill）或宁夏枸杞（L.barbarum L）的干燥根皮，味甘、性寒，具有清热滋阴的功效。本研究通过观察地骨皮对STZ大鼠肾脏COX-2表达的影响，探讨其对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠125只，体重（300±20）g，购自中国科学院上海实验动物中心，由浙江中医药大学SPF动物房饲养。生产许可证：SCXK（沪）2003-0003。

1.2 实验药品 地骨皮提取液（醇提，浓度为每毫升含生药3g，由浙江中药大学附属第一医院中药制剂室提供）。马来酸罗格列酮（葛兰素史克公司，批号05120005）。链脲佐菌素（STZ）（CALBIOCHEM 生产，Cat#5762201，Lot#B56981）；环氧化酶-2 试剂盒（上海仪涛生物仪器有限公司产品，批号GT201202）。

1.3 实验条件 SPF级屏障系统大鼠实验饲养室，温度（23±1）℃，湿度 50%～70%，光照 150～200Lx，12h明暗交替，噪音＜50dB。饮水：自来水过滤灭菌，置于高压灭菌的饮水瓶中自由饮用。高脂高糖饲料：在基础饲料中加入10%猪油、10%蛋黄、0.25%胆固醇、5%蔗糖，并用Co60辐照灭菌。普通饲料：Co60辐照灭菌大鼠全价营养颗粒饲料。喂养方式：自由饮食，每笼饲养3只。造模后，每只大鼠称重、标记编号，每日加饲料3次（9:00、15:00、21:00），每天加水 5次（6:30、9:30、14:30、18:30、21:30）。

1.4 造模与分组 125只SD大鼠，适应性饲养1周，称体重，随机抽取10只，为正常对照组，喂以标准饲料。另115只大鼠按30mg/kg的剂量一次性尾静脉注射STZ，并饲以高脂饲料。3周后，尾静脉取血测随机血糖，间隔2天后禁食8h，球后取血分离血清，测血糖、胰岛素。凡空腹血糖＞7.0mmol/L，体重明显增加者成模。造模后筛选40只大鼠，随机分为模型组、罗格列酮组、地骨皮醇提低剂量组、地骨皮醇提高剂量组，每组10只。

1.5 实验方法 正常对照组、模型组大鼠以10mL/（kg·d）生理盐水灌胃；罗格列酮组大鼠以10mL/（kg·d）罗格列酮灌胃（罗格列酮溶于蒸馏水中，浓度为0.5mg/mL）；地骨皮醇提低、高剂量组大鼠分别以5mL/（kg·d）、10mL/（kg·d）地骨皮醇提取液灌胃。药物治疗周期为7周，1天1次，给药途经与临床拟用途径一致。

各组大鼠均于实验给药前禁食不禁水8h，于清晨空腹球后取血，置事先预备的Eppendorf管中，4℃存放4h，4000rpm低温离心20min，取上清液，分装置-20℃保存备测生化指标、空腹胰岛素。末次给药结束后，禁食不禁水8h，大鼠称重后用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔，用5mL一次性注射器腹主静脉取血5.5mL，置Eppendorf管中，4℃存放4h，4000rpm低温离心20min，取上清液，分装置-20℃保存备测生化指标。并取肾脏组织以4%甲醛固定、石蜡包埋、切片。

1.6 环氧化酶-2测定 采用免疫组化法检测，其中胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每个标本随机观察10个视野，利用Dardrick等采用超微免疫标记半定量标准记录：无胶体金颗粒为阴性（-），计0分；存在胶体金颗粒与背底染色相当可疑为（±），计1分；胶体金颗粒多于背底染色为阳性（+），计2分；密集胶体金颗粒为强阳性（++），计3分。

根据下列公式计算每个标本的平均胶体金强度：IS=∑{（0×F0）+（1×F1）+（2×F2）+（3×F3）}，F：%×10视野，即各计分所占每10个视野面积。所得结果即为各个标本的COX-2积分。

2 实验结果

给药后罗格列酮组和地骨皮醇提取液组肾脏环氧化酶-2表达与模型组比较有明显改善，差异均有统计学意义（P＜0.01），地骨皮醇提高剂量组与罗格列酮组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠肾脏COX-2表达量比较（±s）

表1 各组大鼠肾脏COX-2表达量比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与罗格列酮组比较，▲P＜0.05。

组 别 n/只 COX-2正常对照组 10 0.27±0.08△模型组 10 1.75±0.11*罗格列酮组 10 0.93±0.14△*地骨皮醇提低剂量组 10 1.10±0.15△*▲地骨皮醇提高剂量组 10 0.89±0.12△*

3 讨论

严格的血糖控制虽然能够显著降低DN发生率和延缓DN的病情进展，但仍有40%左右T2DM患者最终会出现DN，这也提示控制血糖并不是防治DN唯一有效的方法。我们用高脂饮食加小剂量STZ注射所制备的T2DM动物模型具有高血糖、高胰岛素血症伴肥胖、脂代谢异常等类似人类T2DM临床特点。

COX是二十碳四烯酸合成前列腺素（PG）过程中的一个关键限速酶，目前已知它有两种同工酶：COX-1和COX-2。COX-1广泛分布于各种组织，一般情况下保持相对稳定，以保证细胞的正常活动。COX-2则主要存在于炎症细胞，促进炎症反应和组织损伤。既往研究显示，T2DM大鼠肾脏COX-2在6周及12周时均呈片状表达，且表达量呈进行性升高，但无异位表达现象。大量的研究表明，糖尿病患者发病早期出现肾小球滤过率增高，而肾小球高滤过是导致DN发生功能与形态学改变的基础[3]。前列腺素代谢异常是肾小球高滤过的因素之一，并与系膜增生以及基质堆积有关[4]。近来研究表明[5-6]，DN大鼠肾组织COX-2表达增加，选择性COX-2抑制剂可改善DN时肾脏损害的进展，使肾小球系膜基质增生得到明显改善，提示COX-2与肾小球的高灌注、高滤过明显相关。因此，COX-2可能是糖尿病肾脏损害的重要因素之一，在DN的发生发展中起着重要的作用。

地骨皮主要成分有多种脂肪酸、生物碱、二酰胺类、甾醇、肽类化合物等[7]，是临床上治疗糖尿病的常用药物，有凉血止血，清热退蒸，清泄肺热，清热滋阴，清热解毒的功效。正符合2型糖尿病的治疗大法“清热润燥，养阴生津”，而且动物实验发现地骨皮有降低血糖[8]、促进胰岛B细胞分泌胰岛素[9]及降低血脂和改善免疫功能等作用[10]。本研究结果表明，地骨皮醇提取液可以降低实验大鼠肾脏COX-2的表达从而对大鼠肾脏起保护作用，且高剂量组作用优于低剂量组。地骨皮提取液中活性成分较多，其疗效是多方面、多靶向的，故治疗2型糖尿病以及糖尿病肾病的机制相对较复杂，确切机制尚不明确，有待于进一步研究。

[1]Molnar M，Wittmann I，Nagy J.Prevalence，course and risk factors of diabetic nephropathy in type-2 diabetes mellitus[J].Med Sci Monit，2000，6（5）:929-936.

[2]Margarete GS，Timo W，Juliane VM，et al.Cox-2 and osteopontin in cocultured and mesangial cells:role of glucocorticoids[J].J Kidney Int，2000，57（6）:2229-2238.

[3]刘志红，黎磊石.糖尿病肾病发病机理[J].中华肾脏病杂志，1999，2（15）:120-123.

[4]王海燕.肾脏病学[M].第2版.北京:人民卫生出版社，1996:129-132.

[5]陈芳，孙世澜.环氧化酶-2抑制剂对糖尿病大鼠肾脏活性作用的研究[J].中国血液流变学杂志，2005，15，（2）:185-189.

[6]刘志纯，周巧玲，欧阳春，等.莫比可对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用[J].中南大学学报（医学版），2004，29（6）:635-638.

[7]王得修.地骨皮治疗糖尿病16例[J].上海中医药杂志，1984，（9）：11-12.

[8]周晶，孟林，黄建安，等.地骨皮对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降糖作用[J].中成药，2001，23（6）:424-425.

[9]张静，李宛青，吴爱群.地骨皮、黄芪对胰岛素释放的作用[J].河南医学研究，2000，9（3）:221-222.

[10]杨晓峰，李升刚，于德志，等.复方地骨皮冲剂对小鼠血糖、血脂及免疫功能的影响[J].齐鲁医学杂志，2000，5（2）:84-86.