3种橡胶膏剂控制菌检查的方法学验证

赵新霞，杨淑先，刘 英，陶 明（河南省食品药品检验所，郑州市 450003）

橡胶膏剂系指中药提取物或化学药物与橡胶等基质混匀后，涂布于背衬材料上制成的贴膏剂。2010年版《中国药典》增加了橡胶膏剂的微生物限度检查，规定每10 cm2不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌[1]。橡胶膏剂中除了主要药用成分外，基质主要为橡胶，另外还含有凡士林、液体石蜡等脂溶性成分。因此选用合适的溶剂来分散基质，使药品溶解，是橡胶膏剂微生物限度检查中制备供试品溶液很关键的步骤，而合适的供试品溶液制备方法对微生物限度检查结果也至关重要。笔者选用3种中药橡胶膏剂，对其进行控制菌检查的方法学验证，以探究橡胶膏剂合适的供试品溶液制备方法及控制菌检查方法[2，3]。

1 材料

1.1 样品

壮骨麝香止痛膏（批号：100604、090701、100304，规格：7 cm×10 cm，主要成分：人工麝香、生草乌、生川乌、乳香、没药、生马钱子、丁香、肉桂、荆芥、防风、老鹳草、香加皮、积雪草、骨碎补、白芷、山柰、干姜、水杨酸甲酯、薄荷脑、冰片、樟脑、芸香浸膏、颠茄流浸膏）、冰樟桉氟轻松贴膏（批号：091016、100613、100203，规格：4 cm×6.5 cm，主要成分：醋酸氟轻松、冰片、樟脑、水杨酸甲酯、桉叶油）、通络祛痛膏（批号：090604、100414、100604，规格：7 cm×10 cm，主要成分：当归、川芎、红花、山柰、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、大黄、樟脑、冰片、薄荷脑）均由河南羚锐制药股份有限公司提供。

1.2 菌种

大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 培养基及稀释剂

营养肉汤培养基（批号：080331）、胆盐乳糖培养基（BL，批号：1003182）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：0808192）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：071107）、营养琼脂培养基（批号：100407）均为北京三药科技开发公司产品；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为自制，按照2010年版《中国药典》规定制备及灭菌。

2 方法与结果

2.1 菌液制备[1]

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养22 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为10～100 cfu的菌悬液，计数。2次菌落计数结果见表1。

表1 菌落计数结果（cfu）Tab 1Results of colony coun（tcfu）

2.2 供试液制备

2.2.1 供试品溶液的制备。取每批样品4片，去掉膏剂的保护层，将无菌纱布覆盖在膏剂的粘贴面上，共取100 cm2的面积，剪碎，将碎片置于含30 mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的输液瓶中，充分振摇。然后加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，振摇，萃取，静置使油水明显分层。用注射器抽取水层，作为1∶10的供试品溶液。

2.2.2 阴性对照组。取30 mL无菌十四烷酸异丙酯，置于含无菌玻璃珠的输液瓶中，加入100 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，振摇，静置使分层。取水层作为阴性对照液。

2.3 试验方法

按照2010年版《中国药典》一部“微生物限度检查法”[1]进行方法学验证，供试品检查同步进行。取3种橡胶膏剂共9批样品，试验分2次进行。

2.3.1 供试品组。①金黄色葡萄球菌：取1∶10供试品溶液10 mL，加入100 mL营养肉汤培养基中培养24 h，分离划线于甘露醇氯化钠琼脂平板上，依照金黄色葡萄球菌的检查方法进行检查。②铜绿假单胞菌：取1∶10供试品溶液10 mL，加入100 mL BL中培养24 h，分离划线于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，依照铜绿假单胞菌的检查方法进行检查。

2.3.2 试验组。①金黄色葡萄球菌：取1∶10供试品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液，加入100 mL营养肉汤培养基中培养24 h，依照金黄色葡萄球菌的检查方法进行检查。②铜绿假单胞菌：取1∶10供试品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的铜绿假单胞菌菌悬液，加入100 mL BL中培养24 h，依照铜绿假单胞菌的检查方法进行检查。2.3.3 阴性菌对照组。①金黄色葡萄球菌：取1∶10供试品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的大肠埃希菌菌悬液，加入100 mL营养肉汤培养基中培养24 h，依照金黄色葡萄球菌的检查方法进行检查。②铜绿假单胞菌：取1∶10供试品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的大肠埃希菌菌悬液，加入100 mL BL中培养24 h，依照铜绿假单胞菌的检查方法进行检查。

2.3.4 阴性对照组。①金黄色葡萄球菌：取阴性对照液10 mL，加入100 mL营养肉汤培养基中培养24 h，依照金黄色葡萄球菌检查方法进行检查。②铜绿假单胞菌：取阴性对照液10 mL，加入100 mL BL中培养24 h，依照铜绿假单胞菌的检查方法进行检查。

2.4 结果

3种橡胶膏剂共9批样品，试验结果均一致，见表2、表3（表中“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长）。

表2 金黄色葡萄球菌验证试验结果Tab 2 Results of verification test for Staphylococcus aureus

表3 铜绿假单胞菌验证试验结果Tab 3 Results of verification test for Pseudomonas aeruginosa

由以上结果可知，3种橡胶膏剂共9批样品，供试品组、阴性对照组以及阴性菌对照组均无菌生长，试验组均检出试验菌，确定这3种样品的控制菌检查均可采用此方法进行。

3 分析与讨论

（1）供试品溶液制备方法的选择，笔者曾采用以下方法进行试验：

方法1：取每批样品4片，去掉贴膏剂的保护层，将无菌纱布覆盖在膏剂的粘贴面上，共取100 cm2的面积，剪碎，将碎片置于含4 mL聚山梨酯-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL中，用力振荡30 min[1]。

方法2：取每批样品4片，去掉贴膏剂的保护层，将无菌纱布覆盖在膏剂的粘贴面上，共取100 cm2的面积，剪碎，将碎片置于含25 mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的输液瓶中，充分振摇。然后加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，振摇，萃取，静置使油水明显分层。用注射器抽取水层，作为1∶10的供试品溶液。

方法3：除无菌十四烷酸异丙酯的用量改为30 mL外，其余均与方法2相同。

在方法1中，振摇后，纱布脱落，贴膏剂的粘贴面相互粘在一起，膏层难以溶解下来，用力振荡，溶液几乎没有任何变化，所以方法1不适合于这3种橡胶膏剂供试品溶液的制备。以十四烷酸异丙酯为溶剂后，曾用20 mL的溶剂量，但样品与溶剂混合得很不充分，所以选用25 mL的溶剂用量开始试验。但在方法2中，加入无菌十四烷酸异丙酯充分振摇后，膏层溶解得不充分，所以方法3将十四烷酸异丙酯的量增加到30 mL，结果膏层完全溶解。所以最终选用方法3作为供试品溶液的制备方法。

（2）由于本试验中所用十四烷酸异丙酯的量为30 mL，比一般用量（20 mL）[1]大，故作相应控制菌检查时增加了阴性对照液的阳性试验，即用10 mL阴性对照液代替供试品溶液做相应控制菌的阳性对照试验。结果表明，阳性菌均检出，说明本次试验所用的十四烷酸异丙酯的量30 mL对控制菌的生长没有影响。

（3）对于非水溶性供试品的供试液制备，需以十四烷酸异丙酯为溶剂进行溶解的，十四烷酸异丙酯的使用量是以能够溶解供试品且对微生物的生长没有影响为基础来确定的。笔者曾进行了十四烷酸异丙酯的用量对微生物生长的影响试验：采用2010年版《中国药典》一部“微生物限度检查法”[1]中非水溶性供试品的供试液制备中的第二法进行试验，以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉为试验菌，当十四烷酸异丙酯的用量增加到100 mL时，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，振摇静置后分别取水层1 mL，加入试验菌，进行回收率的测定，结果表明试验菌的回收率均高于70%。所以，试验中十四烷酸异丙酯的用量对上述试验菌的生长没有明显影响。

（4）试验中3种中药橡胶膏剂成分中均含有冰片[4]，具有抑菌作用；通络祛痛膏中的大黄[5]也有抑菌作用。但因控制菌检查时取1∶10供试品溶液的量为10 mL，其中抑菌成分的含量已较低，所以控制菌的生长没有受到影响。

本次试验所建立的控制菌检查方法有效、可行，可用于所选3种橡胶膏剂的控制菌检查；且3种橡胶膏剂均可采用常规法进行检查。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录9、79.

[2] 李近磊，王嘉怡，迟丹怡，等.复方克林霉素凝胶微生物限度检查法的方法验证研究[J].中国药房，2010，21（25）：2 380.

[3] 韦 曦，邱双成，王翠荣.29种医院制剂微生物限度检查方法验证[J].中国药房，2008，19（1）：52.

[4] 刘 楠，邹佳伶，王黎黎，等.龙脑油与阿莫西林的体外联合抑菌作用观察[J].中国兽医杂志，2010，46（2）：56.

[5] 于风平，杨美琴，特玉香，等.含大黄、黄芩、黄连和黄柏药材的中成药微生物限度检查法的建立[J].药物分析杂志，2010，30（3）：558.