预防性使用英夫利西单抗对肺气肿模型大鼠气道炎症的影响研究Δ

张 程，张湘燕，罗溶溶，饶珊珊，夏 婧，张族勤，朱绍英（贵州省人民医院呼吸内科，贵阳市 550002）

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）能参与慢性阻塞性肺疾病（COPD）气道炎症的形成[1～3]，因此其在肺气肿等发病中的作用越来越受到重视。在国外，相关研究[4]提示，给予英夫利西单抗（TNF-α抑制剂）后，COPD患者气道炎症无明显改善，考虑得到该结果的可能原因是其评估的是英夫利西单抗的治疗作用而非其预防作用。本实验采取单纯香烟熏吸方法建立肺气肿大鼠模型，观察预防性使用英夫利西单抗对模型大鼠血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、白介素（IL）-8、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平及BALF中炎症细胞计数、分类计数的影响，旨在探讨预防性使用英夫利西单抗对模型大鼠气道炎症的影响，为临床上寻找该类疾病可行的预防方法提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

550酶标仪（美国Bio-Rad公司）；DL-5低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

黄果树香烟（贵阳市卷烟厂，焦油含量：每盒19 mg）；英夫利西单抗（瑞士Cilag AG公司，批号：S20060024，规格：每瓶100 mg）；大鼠TNF-α、IL-8、MMP-9酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（上海史瑞可生物科技有限公司）。

1.3 动物

清洁级SD大鼠39只，♂，体重180～252 g，鼠龄10周，购自重庆第三军医大学实验动物中心，生产合格证号：SCXK（渝）2007-0005。

2 方法

2.1 分组给药

将大鼠随机分为正常对照组、模型组和干预组，每组13只，参照笔者已发表文章[5]中自制的大鼠实验性被动吸烟装置对后2组建立肺气肿模型。烟雾暴露达1个月时，以英夫利西单抗对干预组进行干预，皮下注射，10 d 1次，按照文献[6]报道剂量给药，药物经生理盐水溶解，每次给药剂量为5 mg·kg－1，给药量为0.2 mL。正常对照组和模型组大鼠皮下注射生理盐水，10 d 1次，每次0.2 mL。实验过程中，模型组大鼠第40天时死亡1只，干预组第70天时死亡1只，原因均不明。第71天终止英夫利西单抗干预，第74天终止所有处理进行检测。

2.2 BALF中炎症细胞计数和分类计数与血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9的检测

血清和BALF的收集方法[5]：各组大鼠终止所有处理后，从下腔静脉抽取静脉血5 mL，在5 ℃、2 000 r·min－1离心10 min，吸取上部血清，将其置于－70℃冰箱中保存待测。随后，处死大鼠，暴露气管与双肺，将尖端磨平的12号针头连接于5 mL注射器，经气管切口向左肺缓慢注入无菌生理盐水3 mL，每次注入后立即回吸灌洗液（回收率为80%～90%），并经纱布过滤，重复3次。吸取各组大鼠的BALF 0.5 mL至血细胞计数器上计数白细胞总数。剩余BALF离心，取其上清液移入无菌瓶内，并置于－70℃冰箱中待测。细胞沉淀重新混悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并制作4张细胞涂片，Wright-Giemsa染色作炎症细胞分类（巨噬细胞、中性粒细胞）计数（至少计数200个细胞）。另取上述血清和BALF上清液按照试剂盒说明书的要求测定TNF-α、IL-8、MMP-9水平。

2.3 肺组织病理变化检测和形态定量分析

取各组大鼠右下肺，以10%中性福尔马林固定30 min后结扎气管，随后置于10%中性福尔马林中浸泡26 h，其余右肺存于－70℃冰箱中待用。最后石蜡包埋、切片，常规苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察肺组织病理变化。每只大鼠取3个HE染色切片，每片随机取上、中、下、左、右5个视野（避开大血管和支气管），在每个视野正中心划十字交叉线，计算与交叉线相交的肺泡隔数（NS）和每个视野内肺泡数（Na），同时测出十字线总长（L）和每个视野面积（S）。按公式计算平均内衬间隔（MLI＝L/NS），以表示肺泡平均内径；平均肺泡数（MAN＝Na/S），以反映肺泡密度。病理组织读片均采用双盲法。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 BALF中炎症细胞计数和分类计数比较

与正常对照组比较，模型组和干预组大鼠BALF中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数及其占白细胞总数的百分比均明显升高，巨噬细胞数占白细胞总数的百分比明显降低（P均＜0.05）。与模型组比较，干预组大鼠BALF中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数及其占白细胞总数的百分比均明显降低，巨噬细胞数占白细胞总数的百分比明显升高（P均＜0.05）。各组大鼠BALF中炎症细胞计数和分类计数比较见表1。

表1 各组大鼠BALF中炎症细胞计数比较（±s）Tab 1 Comparison of inflammatory cells count in BALF among those groups（±s）

表1 各组大鼠BALF中炎症细胞计数比较（±s）Tab 1 Comparison of inflammatory cells count in BALF among those groups（±s）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

组别正常对照组模型组干预组巨噬细胞数占白细胞总数百分比/%88.36±1.64 80.67±1.87＊83.62±1.88＊#n 13 12 12白细胞总数（×108个/L）1.63±0.34 4.18±0.62＊2.54±0.28＊#巨噬细胞数（×108个/L）1.44±0.31 3.37±0.52＊2.12±0.24＊#中性粒细胞数（×108个/L）0.035±0.064 0.43±0.062＊0.17±0.023＊#中性粒细胞数占白细胞总数百分比/%2.16±0.31 10.42±0.90＊6.91±0.59＊#

3.2 大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比较

与正常对照组比较，模型组和干预组大鼠血清和BALF中IL-8、TNF-α、MMP-9水平均明显升高（P均＜0.05）。与模型组比较，干预组大鼠血清和BALF中TNF-α、MMP-9水平明显降低（P均＜0.05），BALF中IL-8水平明显降低（P＜0.05），血清中IL-8水平无明显变化。各组大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比较见表2。

表2 各组大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比较（±s）Tab 2 Comparison of the levels of TNF-α，IL-8 and MMP-9 in serum and BALF（±s）

表2 各组大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比较（±s）Tab 2 Comparison of the levels of TNF-α，IL-8 and MMP-9 in serum and BALF（±s）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

组别正常对照组模型组干预组BALF 2.94±0.62 6.89±1.61＊4.52±0.69＊#n 13 12 12 TNF-α/pg·mL－1血清22.55±3.07 39.14±4.38＊28.57±3.29＊#BALF 36.02±3.65 60.51±4.01＊41.47±5.31＊#IL-8/pg·mL－1血清23.87±3.28 60.58±6.88＊55.23±6.23＊BALF 80.18±10.51 161.13±23.90＊140.24±19.62＊#MMP-9/ng·mL－1血清3.77±0.40 8.34±1.15＊4.87±0.63＊#

3.3 肺组织病理变化与定量分析结果

显微镜下，正常对照组中少数大鼠可见轻度炎症变化，其余无明显异常，气管内表面纤毛丰富、整齐，未见脱落现象，气管壁结构清楚，在纤毛细胞间夹杂有少量杯状细胞，肺组织结构正常，肺泡间隔完整；模型组大鼠支气管肺内出现较多的慢性炎症细胞浸润，纤毛倒伏、脱落，杯状上皮细胞化生，肺泡壁变薄或断裂，肺泡腔扩大，部分融合成肺大泡；干预组较模型组上述变化都相对减轻。与正常对照组比较，模型组大鼠MLI明显增加，MAN明显减小（P均＜0.05）。与模型组比较，干预组大鼠MLI明显减小，MAN明显增加（P均＜0.05）。各组大鼠肺组织病理变化见图1；MLI、MAN比较见表3。

图1 各组大鼠肺组织病理切片图（HE，×100）Fig 1Pathological slice of lung tissue of rat（sHE，×100）

表3 各组大鼠MLI、MAN比较（±s）Tab 3 Comparison of MLI and MAN among those groups（±s）

表3 各组大鼠MLI、MAN比较（±s）Tab 3 Comparison of MLI and MAN among those groups（±s）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

组别正常对照组模型组干预组MAN（×106个/m2）448.32±28.73 166.62±37.33＊316.81±57.05#n 13 12 12 MLI/μm 41.26±4.50 97.52±23.75＊57.69±7.37#

4 讨论

TNF-α为一种重要的炎症介质，由巨噬细胞、淋巴细胞、肺泡上皮细胞等释放，可参与机体脂肪、蛋白质的分解代谢等病理生理过程。其除了参与溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等发病过程以外，还能促进肺气肿的发生、发展[7]，因此越来越引起人们的关注。本研究结果表明，肺气肿模型大鼠血清和BALF中TNF-α水平较正常对照组明显升高，二者差异具有显著性，说明了其在肺气肿气道炎症中的重要意义。

目前认为TNF-α在COPD发病中的作用是：不但能激活中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等，促进炎症介质释放，还能活化炎症细胞合成炎性细胞因子，在炎症细胞-细胞因子之间形成逐步放大环，促使炎症反应及肺组织破坏；TNF-α能增强血管黏附分子和中性粒细胞化学趋向素或趋化因子等的表达，引起中性粒细胞的迁移和活化，导致破坏性的氧化剂和蛋白酶的释放，促进气道炎症的发生和持续发展。

鉴于TNF-α在上述多种疾病中的重要作用，目前有许多学者均致力于TNF-α抑制剂在临床上的应用研究。国外已有研究[6]以不同剂量（5、10、15 mg·kg－1）的英夫利西单抗干预结肠炎模型大鼠，结果发现，干预组大鼠肠道炎症等病理变化较模型组明显减轻，其中低剂量组（5 mg·kg－1）疗效最为显著。说明该药在临床应用中可能存在巨大的潜力，可望在COPD等具有类似发病特点的疾病治疗中发挥重要作用，因此值得进一步研究。但近期研究却没有得到人们预期的效果。有文献[4]报道COPD患者使用英夫利西单抗治疗后，不仅临床症状无明显好转，其气道炎症也无明显改善，推测该结果的可能原因与用药时机有关，一旦COPD进展到一定时期，其病理变化就很难逆转，故治疗效果欠佳。

根据预实验结果笔者发现，烟雾暴露34 d左右大鼠才开始出现轻度肺气肿，因此在烟雾暴露30 d时进行干预即属预防性使用，可能达到较好的预防效果。

本实验结果显示，与模型组比较，干预组大鼠血清和BALF中TNF-α、MMP-9水平以及BALF中IL-8水平均明显降低；其肺组织炎症细胞浸润也相应减轻，BALF中中性粒细胞数占白细胞总数的百分比也明显降低。其一方面进一步验证了TNF-α在肺气肿发病中的重要作用，另一方面还提示预防性使用英夫利西单抗可通过拮抗细胞因子和抑制局部炎症细胞浸润改善气道炎症；同时，由于反映肺气肿程度的相关指标也有所改善，所以笔者推测预防性使用英夫利西单抗可减轻肺气肿模型大鼠的气道炎症，其可能通过拮抗细胞因子和抑制局部炎症细胞浸润而发挥作用。鉴于目前尚缺乏有效的对抗肺气肿气道炎症的药物，TNF-α抑制剂的抗炎作用值得在临床上进一步研究探讨。

[1] 牛颖梅，童朝晖，王 辰，等.稳定期慢性阻塞性肺疾病气道炎症的研究[J].国际呼吸杂志，2009，29（3）：132.

[2] Aaron S，Angel JB，Lunau M，et al.Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med，2001，163（2）：349.

[3] De Boer WI.Cytokines and therapy in COPD：a promising combination?[J].Chest，2002，121（5 Suppl）：209S.

[4] vander Vaart H，Koëter GH，Postma DS，et al.First study of infliximab treatment in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med，2005，172（4）：465.

[5] 张 程，陈 平，蔡 珊，等.重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30（6）：432.

[6] Triantafillidis JK，Papalois AE，Parasi A，et al.Favorable response to subcutaneous administration of infliximab in rats with experimental colitis[J].World J Gastroenterol，2005，11（43）：6 843.

[7] 陈雪英，刘 芹，何 艳，等.慢性阻塞性肺疾病患者血浆生物介质的临床意义及糖皮质激素疗效相关性研究[J].中华老年医学杂志，2007，26（6）：446.