丹黄通络胶囊对老年痴呆大鼠学习记忆能力及脑内胆碱能系统的影响

张小毅 李生莹 潘国聘 詹合琴 (新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

阿尔茨海默病(AD)〔1，2〕，俗称老年性痴呆，是多发于老年前期或老年期的一种以进行性智能减退为特征的中枢神经系统退行性疾病。随着全球人口老龄化程度的加快，AD的发病率呈指数上升，严重威胁着老年人的健康和生活质量，已成为国内外医学界的又一研究热点。目前AD的病因、发病机制尚未完全清楚，缺乏有效的西医治疗措施，因此开发利用中药复方，发挥中医优势来治疗该病十分重要。本研究使用的中药复方制剂丹黄通络胶囊具有“活血化瘀、益气通络、滋补肝肾”等作用，对延缓衰老有较好疗效，但其对AD是否有改善作用及机制尚不清楚，故本实验采用侧脑室内注射β淀粉多肽25～35片段(Aβ25～35)建立AD大鼠模型，观察不同剂量丹黄通络胆囊对AD模型大鼠学习记忆能力及脑内胆碱能系统的影响，进而探讨其作用及机制，为临床应用提供理论支持。注射Aβ25～35建立AD大鼠模型，观察不同剂量丹黄通络胶囊对AD模型大鼠学习记忆能力及脑内胆碱能系统的影响，进而探讨其作用及机制为临床应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 5月龄健康Wistar大鼠，雌雄各半，体重250～260 g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(黔)2002-0001。

1.1.2 药品与主要试剂 丹黄通络胶囊:0.48 g/粒，含原生药1.6 g/粒，批号:050526，贵阳天阳生物技术开发有限公司;β淀粉样蛋白:Aβ25～35，批号:114k4773，Sigma 公司;胆碱乙酰转移酶(ChAT)检测试剂盒及乙酰胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 实验动物筛选、分组 适应性喂养1 w后，取Wistar大鼠进行Morris水迷宫训练，淘汰掉学习成绩太好(逃避潜伏期≤5 s)和太差(逃避潜伏期≥40 s)者，其余纳为合格大鼠。将筛选合格的50只大鼠按训练成绩及性别均衡随机分为正常对照组、AD模型组、丹黄通络胶囊低、中、高剂量组(0.16，0.32，0.64 g/kg)，每组10 只。

1.2.2 模型制备及给药 各组大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，预定侧脑室注射进针坐标为:AP-1.3 mm(前囟后)，ML-1.8 mm(中线左侧)，H-3.9 mm(自颅骨表面起的深度)。定位后钻开颅骨，微量注射器垂直进针3.9 mm，AD模型组及给药组于侧脑室缓慢注入2 μl聚集态Aβ25～35，留针5 min，缝合伤口。正常对照组注入等体积无菌生理盐水。术后次日丹黄通络胶囊低、中、高剂量组开始按既定剂量灌胃给药，每日1次，连续20 d，正常对照组及AD模型组均给予等容量蒸馏水。

1.2.3 Morris水迷宫测试AD大鼠学习记忆能力 各组大鼠在药物干预结束后开始水迷宫检测。①定位航行实验:每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练2次，分别从4个不同的标记点将大鼠面向池壁放入水中，记录120 s内寻找平台所需时间(逃避潜伏期)，每次训练间隔60 s，共历时5 d。如果大鼠在120 s内仍未找到平台，则将其置于平台上并停留10 s，潜伏期记为120 s。②空间探索实验:于定位航行实验结束的第2天进行。撤除平台，任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录120 s内大鼠在平台象限的游泳时间及在平台象限游泳距离占总游程的百分比。

1.2.4 脑组织中ChAT、AchE活力的测定 行为学测试完成后迅速处死大鼠，在冰盘上断头取脑，将右侧脑组织用冰生理盐水冲洗，除去血液，滤纸吸干，电子天平称重。在冰浴下用玻璃匀浆器制备10%的脑组织匀浆，用比色法测定脑组织中ChAT、AchE的活力，所有操作严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。

1.2.5 免疫组化法检测海马神经元M1受体的表达 将左侧脑组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，制成5 μm厚连续切片，行SABC免疫组化法染色。每个动物取3张切片，每张切片随机取互不重叠的5个视野，在高倍镜下(×400)采用Biomias99图像分析系统检测M1受体的平均灰度值(Mean Gradation，MG)。

2 结果

2.1 丹黄通络胶囊对AD模型大鼠学习记忆能力的影响 造模前各组大鼠的Morris水迷宫实验成绩无显著性差异，造模后与正常对照组比较，AD模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)，在平台象限停留的时间和在平台象限游程占总游程的百分比较明显降低(P＜0.05);表明AD模型成功，使用丹黄通络胶囊灌胃后，与AD模型组大鼠相比较，给药组大鼠逃避潜伏期明显缩短，在平台象限停留的时间和在平台象限游程占总游程的百分比明显增加(P＜0.05)。见表1。

2.2 丹黄通络胶囊对AD模型大鼠脑组织中ChAT、AchE活力的影响 与正常对照组比较，AD模型组大鼠脑组织中ChAT活力明显降低，同时AchE活力显著增强，差异具有统计学意义(P＜0.01);与AD模型组比较，丹黄通络胶囊各剂量组ChAT活力均升高，AChE活力均下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，且具有一定的量效关系。见表2。

2.3 丹黄通络胶囊对海马神经元M1受体表达的影响 与正常对照组比较，AD模型组大鼠海马神经元胞膜染色变浅，平均灰度值明显增大，差异具有统计学意义(P＜0.01);与AD模型组比较，丹黄通络胶囊低、中、高剂量组海马神经元胞膜黄染不同程度加深，平均灰度值逐渐降低，呈剂量依赖性，且中、高剂量组差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见表2，图1。

表1 各实验组大鼠水迷宫实验结果(±s，n=10)

表1 各实验组大鼠水迷宫实验结果(±s，n=10)

与正常对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与AD模型组比较:3)P ＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

组别 潜伏期(s)平台象限停留时间(s)平台象限游程/总游程(%)6.07±1.46 52.17±12.76 49.93±3.98 AD模型组 16.98±7.871)32.31±8.971)30.95±4.031)丹黄通络胶囊低剂量组 12.55±7.76 40.47±10.57 37.54±6.15丹黄通络胶囊中剂量组 8.01±3.313) 39.56±6.99 42.78±9.613)丹黄通络胶囊高剂量组 5.61±2.793)47.23±8.973)50.32±8.043)正常对照组

表2 各实验组大鼠ChAT、AchE活力及M1受体的表达(±s，n=10)

表2 各实验组大鼠ChAT、AchE活力及M1受体的表达(±s，n=10)

257.45±31.09 0.43±0.05 161.53±12.25 AD模型组 156.74±19.562) 1.12±0.292) 185.90±11.352)丹黄通络胶囊低剂量组 196.76±35.80 0.32±0.054) 150.42±26.22丹黄通络胶囊中剂量组 206.80±21.134) 0.22±0.044) 142.78±8.323)丹黄通络胶囊高剂量组 259.81±27.784) 0.21±0.054) 98.89±10.654)平均灰度值正常对照组组别 ChAT(U/g) AchE(U/mgprot)

图1 各实验组大鼠海马神经元M1受体的表达(×400)

3 讨论

随着全世界人口的老龄化，AD已经成为威胁人类晚年生活质量的主要疾病之一，其发病率呈逐年上升的趋势。AD是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统变性疾病，患者在疾病早期就出现智力和记忆力衰退，并可波及记忆的全过程。由于至今AD的发病机制仍不清楚，但可以肯定的是AD的病因是多方面的，因此，单一靶点的药物很难取得满意疗效，大量的研究资料表明〔3～5〕，中药治疗疾病具有多靶点的特点，在发掘治疗AD的新药方面具有广阔的前景。本研究所使用的丹黄通络胶囊就是一种中药的复方制剂，由丹参、黄芪、银杏叶等五味中药组成。丹参是常用的活血化淤中药，黄芪是益气之品，银杏叶具有扩张血管、降低血液黏稠度、清除自由基、抗缺氧等功效，因而，丹黄通络胶囊具有“活血化瘀、益气通络、滋补肝肾”等作用，对于“肾虚精亏、瘀血阻络”的AD发病机制可进行多靶点针对性治疗。本实验结果也显示，使用丹黄通络胶囊治疗后，AD大鼠逃避潜伏期缩短，在平台象限停留的时间和在平台象限游程占总游程的百分比增加，这都说明丹黄通络胶囊能够改善AD模型大鼠的空间学习和记忆能力。

中枢胆碱能系统与学习记忆功能密切相关，主要通过膈区-海马-边缘叶和大脑皮质两条通路特异性调节第一级记忆转入第二级记忆的过程〔6〕。乙酰胆碱是其中的重要神经递质之一，它由胆碱和乙酰辅酶A在ChAT的催化下合成，以囊泡泡吐形式进入突触间隙，进而作用于突触后膜的Ach受体，介导信息的传递，参与学习记忆功能的完成，之后就被AchE迅速水解〔7〕。在此过程中，ChAT和AchE是调节脑内ACh含量的两个关键酶，其活性变化可间接反映脑内Ach的代谢情况。其中ChAT在胆碱能神经元胞体内合成，其在中枢神经系统内的分布与Ach平行，故常作为胆碱能神经的标志酶，是估计Ach含量的间接指标〔8〕。早在70年代Deutsch等在实验中发现动物注射拟胆碱药能增进学习记忆能力，而注射抗胆碱药则可以减弱学习记忆能力〔9〕。大量临床研究也显示〔10，11〕，AD 患者均有不同程度的ChAT、AchE和Ach合成、释放、摄取等功能障碍，并伴有胆碱能神经元的变性和缺失。随着衰老病程的进展，患者大脑皮质、基底前脑及海马等部位的胆碱能神经元的数目和ChAT的活性明显下降，并与痴呆的严重程度密切相关。本实验结果表明，丹黄通络胶囊不仅能够降低AchE的活性，增强ChAT的活性，而且能够提高海马神经元细胞膜上M1受体表达，从而增加脑内Ach的含量，对胆碱能系统有明显的调节作用，代偿AD发病过程中胆碱能神经元的丢失和Ach含量的减少，这可能是丹黄通络胶囊改善学习记忆功能的机制之一。

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