乌司他丁对内毒素血症大鼠心肌TOLL样受体4表达的影响

王叶舟 谢良地 韩 英 (福建医科大学附属第一医院干部病房，福建 福州 350003)

内毒素(LPS)致心肌损伤主要是激活心肌Toll样受体4(TLR4)，Foster等〔1〕发现 TLR4 能够持续诱导 NF-κB 的活性，上调炎症因子表达(如TNF-α、CRP、IL-6)。乌司他丁(UTI)是一种从人尿中分离纯化的蛋白酶抑制剂，是一种分子量67 000 D的糖蛋白。UTI具有抑制多种蛋白、糖和脂类的水解酶的活性，抑制炎症介质的过度释放，有保护心肌的作用〔2〕。目前未有UTI对心肌TLR4表达影响的报道。本研究拟观察UTI对内毒素血症大鼠心肌TLR4表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠(8周龄)40只，体重(200±20)g，由中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司提供，所有动物都饲养在本研究所动物房，恒温(22℃ ±2℃)、恒湿(55% ±5%)、人工光照明暗各12 h。24 h自由取食和饮水。饲料由上海必凯公司提供。

1.1.2 主要试剂及药品 即用型S-P试剂盒、TLR4抗体、辣根过氧化物酶标记的山小鼠IgG、Western印迹化学发光试剂、抗βactin、免疫印迹化学发光试剂(Santa Cruz公司);RT-PCR试剂盒、Marker(Ferments公司);M-MLV反转录酶、ligo(dT)15(美国Promega);Taq酶(大连宝生物公司)，硝酸纤维素膜(Amersham公司);蛋白质分子量标准(中国科学院上海生物化学研究所);LPS(美国Sigma公司);DXM(浙江新昌制药厂);UTI(广东天普生化医药股份有限公司)，TNF-αELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司);TLR4和内参B-actin引物设计、合成、测序由上海Invitrogen公司完成;其他常用试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组 SD大鼠随机分为正常对照组，内毒素血症组(LPS组)，LPS+乌司他丁组，LPS+地塞米松组，每组10只。

1.2.2 静脉注射LPS致急性脓毒血症动物模型建立 取SD大鼠给10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。除正常对照组外，其余三组暴露阴茎静脉，给予脂多糖8 mg/kg大鼠阴茎静脉注射，乌司他丁组与LPS+地塞米松组同时注射乌司他丁2.5万U/kg、地塞米松5 mg/kg，正常对照组给予同量的生理盐水;术后室温3 h后取血及心肌后处死大鼠。HE染色观察心肌病理改变。

1.2.3 检测指标 ELISA法测血浆TNF-α，CRP含量。放免法测心肌组织中AngⅡ、IL-6水平。反转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)法测心肌组织TLR4 mRNA和TNF-α mRNA的表达。免疫组化法测心肌中的TLR4蛋白表达。蛋白免疫印迹法测心肌组织TLR4蛋白的表达。

2 结果

2.1 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠血浆中TNF-α mRNA及蛋白表达的影响 与对照组相比，LPS组血浆TNF-α mRNA及蛋白水平明显增高(P＜0.05);与LPS组相比，LPS乌司他丁组TNF-α mRNA及蛋白表达显著降低，与LPS+地塞米松组无明显差别。见表1。

2.2 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠血浆CRP、IL-6、AngⅡ水平的影响 与正常对照组相比，LPS组血浆CRP、IL-6、AngⅡ水平明显增高(P＜0.05);与LPS组相比，LPS+乌司他丁组CRP、IL-6、AngⅡ水平显著降低，LPS+与地塞米松组无明显差别。见表2。

2.3 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠心肌TLR4 mRNA及蛋白表达的影响 与正常对照组相比，LPS组心肌TLR4 mRNA表达水平显著增高(0.601±0.126 vs 0.089±0.011，P＜0.01);乌司他丁明显抑制心肌TLR mRNA的表达，与LPS组相比，LPS+乌司他丁组心肌TRL4 mRNA表达水平明显降低(0.393±0.115 vs 0.601±0.126，P ＜0.05);与 LPS+地塞米松组(0.147±0.042)相比也有明显差异。

免疫组化法显示，与正常对照组相比，LPS组心肌组织TLR4蛋白表达水平显著增高(661.33±162.34 vs 156.81±16.25，P＜0.01);乌司他丁明显抑制心肌中TLR4蛋白的表达，与LPS组相比，LPS+乌司他丁组心肌TLR4蛋白表达水平明显降低(501.64±131.76 vs 661.33±162.34，P＜0.05)，与LPS+地塞米松组(401.77±110.75)比较也有明显差异。蛋白免疫印迹法显示，与正常对照组相比，LPS组心肌TLR4蛋白表达水平显著增高(0.349±0.137 vs 0.083±0.019，P＜0.01);与LPS组相比，LPS+乌司他丁组心肌TLR4蛋白表达水平明显降低(0.174±0.055 vs 0.349±0.137，P＜0.05)，LPS+地塞米松组TLR4蛋白表达水平为(0.106±0.016)。见图1，图2。

表1 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠血浆中TNF-α mRNA及蛋白表达的影响(±s)

表1 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠血浆中TNF-α mRNA及蛋白表达的影响(±s)

组别 TNF-α 蛋白 TNF-αmRNA正常对照组11.16±1.64 0.111±0.023 LPS组 20.64±2.611) 1.039±0.1781)LPS+乌司他丁组 15.67±2.212) 0.266±0.1082)LPS+地塞米松组 13.69±2.732) 0.217±0.0892)

表2 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠血浆中CRP、IL-6、AngⅡ表达的影响(±s)

表2 乌司他丁对LPS诱发SD大鼠血浆中CRP、IL-6、AngⅡ表达的影响(±s)

组别 CRP IL-6 AngⅡ正常对照组1.71±0.41 80.36±15.76 338.34±67.18 LPS组 5.19±0.781) 265.08±39.861)1 093.88±227.031)LPS+乌司他丁组 4.17±0.562) 202.27±46.812)678.56±168.422)LPS+地塞米松组 3.32±0.962) 138.52±19.082)428.43±91.412)

图1 TLR4蛋白Western印迹

图2 心肌组织TLR4蛋白表达免疫组化

3 讨论

TLR4是Toll样受体家族的成员之一，能够识别LPS〔3〕。内毒素血症心肌TLR4表达是增加的〔4，5〕，LPS激活 TLR4介导的信号通路激活NF-κB，NF-κB进入胞核调控一系列炎症介质的基因表达，TNF-α、IL-l等原发性炎症介质增加，形成炎症〔6〕。RAS与脓毒症关系密切〔7〕，内毒素血症时循环RAS被激活同时，组织内RAS系统即开始激活，陆国平等发现局部组织AngⅡ水平与脏器损伤程度相关〔8〕。UTI是一种蛋白酶抑制剂，具有很广的抑酶谱和抑酶活性，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、巯基酶、纤溶酶等多种蛋白酶;UTI也是一种溶酶体膜稳定剂，能抑制溶酶体酶的释放;此外，UTI还能抑制炎性介质的释放，对心肌有保护作用。

本研究再次证实内毒素血症时血中TNF-α、CRP、IL-6炎症介质增加，心肌局部TNF-α表达增加和AngⅡ水平明显增高，出现局部炎症及心肌损伤。本试验再次证实UTI在降低血中炎症介质水平同时，降低TLR4 mRNA和蛋白的表达，减少心肌细胞TNF-α mRNA表达，并能降低心肌组织AngⅡ水平而保护心肌组织。

已有研究〔9〕显示 UTI能减少 NF-κB 表达，从而降低TNF-α、CRP及IL-6等炎症介质水平。本研究发现UTI不仅能降低TNF-α mRNA表达，还能降低TLR4 mRNA及TLR4蛋白表达。由于TLR4是内毒素导致组织细胞炎症和损伤的始动环节，而UTI通过降低TLR4表达抑制LPS诱导的炎症反应，但本研究未进一步明确UTI这种作用是直接还是间接的，需要进一步实验证实。

1 Foster SL，Hargreaves DC，Medzhitov R，et al.Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications〔J〕.Nature，2007;447(7147):972-8.

2 孙传玉，邵 伟，毕严宾.不同剂量乌司他丁的心肌保护作用观察〔J〕.山东医药，2005;45(24):71-2.

3 Gioannini TL，Weiss JP.Regulation of interactions of gramnegative bacterial endotoxins with manlmalian cells〔J〕.Immunol Res，2007;39(1/3):249-60.

4 张德明，李永旺，毛宝龄.内毒素血症大鼠心肌TLR4与IL-18 mRNA表达的变化〔J〕.肺血管病杂志，2003;22(2):109-10.

5 尹海燕，韦建瑞，张 锐.脓毒症大鼠心肌细胞Toll样受体4和炎症因子基因表达的变化及作用机制〔J〕.中国危重病急救医学，2009;21(8):488-91.

6 沈 婷，白建文.Toll样受体4与脓毒症关系的研究进展〔J〕.上海交通大学学报(医学版)，2011;2(2):243-6.

7 李晶铃，阴赫宏，张淑文，等.局部肾素血管紧张素系统与脓毒症〔J〕.中国危重病急救医学，2004;16:639-40.

8 陆国平，邬惊雷，陆铸今.内毒素休克家兔心、肺组织局部血管紧张素系统变化〔J〕.小儿急救医学，2005;12(5):389-91.

9 沈美华，霍正禄，梅 冰，等.乌司他丁对失血性休克复合内毒素模型兔肺组织中核因子-κB的影响〔J〕.中国急救医学，2008;28(12)1102-6.