三氧化二砷联合维生素C对耐药性肺腺癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Survivin活性的影响

曾锦荣 蒋碧佳 王绩英 (桂林医学院附属医院呼吸内科，广西 桂林 541001)

近年来国内外应用三氧化二砷(AS2O3)治疗白血病已取得令人瞩目的进展，并尝试AS2O3用于抑制实体瘤的增殖。目前，有研究已证实AS2O3对肺癌有抑制作用且呈剂量依赖关系但剂量过高虽然可诱导癌细胞凋亡，但同时可致细胞毒杀伤作用可能对正常细胞产生细胞毒性作用致细胞坏死。有研究显示维生素(Vit)C对化疗药物所致细胞损伤具有保护作用，且对AS2O3抗癌作用具有协同性。此研究应用As2O3联合Vit C对人耐药肺腺癌裸鼠移植瘤模型进行干预观察抑瘤效果，探讨其抑瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和瘤株 实验动物:BALB/c-nu裸鼠40只，鼠龄6～8周龄，体质量16～24 g，由桂林医学院实验动物中心提供(合格证号:SCXK桂2007-0001)。瘤株:肺腺癌耐药株A549/R(实验室自备)。

1.1.2 药物及试剂 DMEM高糖型细胞培养液(GIBCOL公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司);AS2O3注射液(哈尔滨伊达药业有限公司);Vit C注射液(天津药业集团新郑股份有限公司);Trizol(TaKaRa公司)、PCR反应体系(TaKaRa公司)、DNA marker(TaKaRa公司);Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA引物(上海生工生物工程技术服务有限公司);Survivin、Caspase-3一抗(Santa Cruz公司)，辣根酶标记抗小鼠IgG二抗，辣根酶标记抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术公司);Western印迹及IP细胞裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，预染蛋白质分子量标准，超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);PVDF膜/0.22 μm(Millipore公司);柯达X-OMAT BT医用X射线胶片(Kodak公司)。

1.1.3 仪器 CO2培养箱(德国Thermo scientific公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置相差显微镜(德国ZEISS公司)，LegendMiro21微量台式高速离心机(德国Thermo scientific公司)，5804R多功能高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，MLDEL680酶标仪(美国 Bio-RAD公司)，Personal48 PCR仪(德国Biometra公司)，紫外分光光度计(德国Eppendorf公司)，JS-780全自动数码凝胶成像分析系统(培清科技)，DYY-6D电泳仪电源(北京六一仪器厂)，DYCP-31A琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂)，MINI-4垂直电泳仪(美国Bio-RAD公司)，Image-Pro Plus 6.0图像处理分析软件。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及裸鼠移植瘤模型建立 A549/R细胞置于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中传代培养。每2～3天换液1次，4 d传代。取指数生长期A549/R细胞加入0.25%胰蛋白酶消化1 min，消化期间不断摇晃培养瓶，至细胞变圆。加入4 ml含血清培养基终止消化，并轻轻反复吹打贴壁细胞，使细胞从瓶壁上脱落，将细胞转至无菌离心管中，细胞悬液计数、台盼蓝染色。确定细胞活力在95%以上，细胞不成团，再以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入PBS洗3次，最后调整细胞浓度为1×108个/ml细胞悬液备用。

取上述细胞悬液以0.2 ml/鼠接种于裸鼠右前肢腋窝皮下，接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，按规定时间测量肿瘤体积大小，肿瘤长至体积约为100～130 mm3左右且无自发性出血、坏死及感染病灶时为模型建立成功。

1.2.2 分组及处理 选择荷瘤成功的裸鼠30只，随机分5组，每组6只。对照组:只给予生理盐水，0.2 ml/次皮下注射，每48 h注射1次，共8次;Vit C组:按250 mg/kg给药;1.5、3.0 mg/kg AS2O3组分别给 AS2O31.5、3.0 mg/kg;AS2O3联合Vit C组:予给1.5 mg/kg AS2O3和250 mg/kg Vit C。

1.2.3 观察指标及方法

1.2.3.1 移植瘤体积及抑制率 每周测量肿瘤长、宽最大垂直直径，按公式计算肿瘤体积。用药结束后2 d处死裸鼠，取出肿瘤，称质量。按公式计算肿瘤抑制率。肿瘤体积(mm3)=(肿瘤长径×肿瘤短径2)/2。抑瘤率=(对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

1.2.3.2 免疫组化检查 将移植瘤标本4%多聚甲醛固定，石蜡切片，免疫组织化学染色检测肿瘤组织Caspase-3、Survivin蛋白表达情况。细胞胞质染色为棕色至棕褐色为阳性细胞标志。每组随机选3个标本，每个标本在高倍镜下随机选取5个视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像处理分析软件，分析阳性细胞光密度值(OD值)，判断药物对肿瘤Caspase-3、Survivin蛋白的影响。

1.2.3.3 RT-PCR检测肿瘤Caspase-3、Survivin mRNA的表达水平 液氮研磨组织提取总RNA，取100 mg组织加入1 ml Trizol，提取总 RNA。紫外分光光度计测定 OD260及 OD280值，分析RNA纯度并调整浓度。逆转录反应(cDNA的制备)反应体系按试剂盒说明进行。Caspase-3 mRNA上游引物:5'-TTG GAA CAA ATG GAC CTG TTG ACC TG-3'，下游引物:5'-GGA CTC AAA TTC TGT TGC CAC CTT TC-3'，扩增产物365 bp;Survivin mRNA上游引物:5'-CCC TTT CTC AAG GAC CAC CGC ATC-3'，下游引物:5'-GCC AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3'，扩增产物133 bp;β-actin上游引物:5'-AGT GTG ACG TGG ACA TCC GCA-3'，下游引物:5'-ATC CAC ATC TGC TGG AAG GTG GAC-3'，扩增产物243 bp。PCR条件:94℃预变性5 min，94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 45 s，共 30 个循环，72℃延伸 7min。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB显色应用凝胶成像系统对电泳条带进行扫描分析，计算相对表达水平。

1.2.3.4 Western印迹检测肿瘤Caspase-3、Survivin蛋白表达水平 液氮研磨组织提取蛋白，取100 mg组织加入0.75 ml细胞裂解液提取总蛋白。运用BCA法测定蛋白量。每例取50 μg，与4×上样缓冲液混合后煮沸5 min，在15%SDS-PAGE电泳，然后电转移至0.22 μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入Caspase-3、Survivin兔多抗IgG一抗(稀释浓度1∶200)4℃孵育过夜，辣根酶标记抗兔IgG二抗(稀释浓度1∶8 000)37℃孵育1 h;β-actin鼠单克隆抗体一抗(稀释浓度1∶1 000)4℃孵育过夜，辣根酶标记抗鼠IgG二抗(稀释浓度1∶8 000)37℃孵育1 h，ECL荧光显色后暗室X片曝光。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，实验重复3次，采用单因素方差分析和χ2检验。

2 结果

2.1 一般性观察 裸鼠体内成瘤情况40只裸鼠，有38只荷瘤成功，成瘤率95%，成瘤时间为细胞种植后第7～16天。肿瘤细胞种植后第21天左右，肿瘤直径平均达5 mm。实验前各组裸鼠一般状态良好;实验结束时30只裸鼠全部存活。动态观察发现，生理盐水组裸鼠活动减少，反应迟钝;4个治疗组裸鼠觅食、饮水、活动等状况良好，未发现腹泻、淤血等现象。

2.2 体重变化 各组治疗前裸鼠体质量均无显著性差异，治疗后1.5，3 mg/kg AS2O3组及AS2O3+Vit C组裸鼠体质量无统计学差异，对照组与Vit C组较其他组体质量减少(P＜0.05)。见表1。

2.3 肿瘤体积及质量变化 各组裸鼠治疗前肿瘤体积无统计学差异具有可比性;治疗 7 d后 1.5，3 mg/kg AS2O3组及AS2O3+Vit C组裸鼠肿瘤体积与对照组相比明显减小(P＜0.05);治疗14 d后1.5，3 mg/kg AS2O3组及 AS2O3+Vit C组裸鼠肿瘤体积较对照组肿瘤明显减小(P＜0.01);以联合用药组最为明显，抑瘤率为79.93%，其次为AS2O33.0 mg/kg组(66.25%)。见表2，表3。

表1 各组治疗前后裸鼠体质量变化(s，n=6，g)

表1 各组治疗前后裸鼠体质量变化(s，n=6，g)

与对照组、Vit C组比较:1)P＜0.05

组别 治疗前 治疗后对照组18.49±1.52 17.84±0.78 Vit C组 18.59±2.16 17.76±1.97 1.5 mg/kg AS2O3组 17.76±1.27 18.73±1.391)3.0 mg/kg AS2O3组 18.67±1.57 20.51±1.821)AS2O3+Vit C组 19.30±2.48 21.19±2.671)

2.4 免疫组织化学染色检测肿瘤组织Caspase-3、Survivin蛋白表达情况 单用Vit C组Caspase-3、Survivin表达无显著改变，用As2O3组随着浓度的增加，Caspase-3表达增加，阳性率增高、Survivin表达减少阳性率降低。联合用药组对Caspase-3、Survivin表达的影响亦明显，与单用Vit C及1.5 mg/kg As2O3组相比有显著性差异(P＜0.05)。见图1、图2，表4。

表2 各组治疗前后裸鼠肿瘤体积变化( s，n=6，mm3)

表2 各组治疗前后裸鼠肿瘤体积变化( s，n=6，mm3)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 治疗前 治疗7 d 治疗14 d对照组108.97±5.51 2 536.86±135.14 3 443.89±168.37 Vit C组 114.32±9.58 2 480.66±158.67 3 323.78±191.37 1.5 mg/kg AS2O3组 112.42±5.55 2 131.65±166.051)1 986.34±192.27 3.0 mg/kg AS2O3组 115.05±8.09 1 395.66±271.411)1 162.36±217.052)AS2O3+Vit C组 116.96±16.84 884.99±254.091)691.13±217.312)

表3 各组治疗后裸鼠肿瘤体质量及抑瘤率(± s，n=6)

表3 各组治疗后裸鼠肿瘤体质量及抑瘤率(± s，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.01

组别 肿瘤质量(g) 抑瘤率(%)对照组2.92±0.14 －Vit C组 2.82±0.16 3.42 1.5 mg/kg AS2O3组 1.69±0.16 42.3 3.0 mg/kg AS2O3组 0.99±0.181) 66.25 AS2O3+Vit C组 0.59±0.181)79.93

图1 Caspase-3蛋白的免疫组织化学结果(DAB，×400)

图2 Survivin蛋白的免疫组织化学结果(DAB，×400)

表4 Caspase-3、Survivin蛋白阳性细胞平均光密度值比较( s，n=15)

表4 Caspase-3、Survivin蛋白阳性细胞平均光密度值比较( s，n=15)

与对照组比较:1)P＜0.05;下表同

组别Caspase-3 Survivin对照组0.205±0.083 0.628±0.137 Vit C组 0.226±0.0311) 0.562±0.1281)1.5 mg/kg As2O3组 0.419±0.0851) 0.253±0.0721)3.0 mg/kg As2O3组 0.663±0.131) 0.211±0.0831)As2O3+Vit C组 0.664±0.0651) 0.169±0.0481)

2.5 PCR检测结果 As2O3能下调Survivin mRNA的表达，上调Caspase-3 mRNA的表达，与剂量呈正相关，单用Vit C对Survivin、Caspase-3 mRNA没有明显的作用，但Vit C联合低剂量As2O3则能明显抑制Survivin mRNA的表达及有效上调Caspase-3 mRNA的表达，效果略优于单用高剂量As2O3组。见图 3，表 5。

2.6 Western印迹检测结果 见图4。As2O3能使无活性Pro-Caspase-3转化为有活性的Caspase-3发挥凋亡作用，且呈剂量依赖性。Vit C联合低剂量As2O3则能明显上调Caspase-3蛋白表达，效果优于单用高剂量As2O3组。As2O3亦能有效下调Survivin蛋白的表达，呈剂量依赖性，单用Vit C对Caspase-3、Survivin作用，但Vit C联合低剂量As2O3则能明显抑制 Survivin，效果优于单用高剂量As2O3组。

图3 各组Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA表达水平

图4 各组Caspase-3、Survivin蛋白表达

表5 各组Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表达水平比较(± s，n=6)

表5 各组Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表达水平比较(± s，n=6)

组别Caspase-3 mRNA Survivin mRNA对照组0.061±0.029 0.553±0.072 Vit C组 0.167±0.037 0.504±0.069 1.5 mg/kg As2O3组 0.386±0.04 0.468±0.049 3.0 mg/kg As2O3组 0.632±0.0421) 0.257±0.0671)As2O3+Vit C组 0.806±0.0281) 0.160±0.0591)

3 讨论

诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞，不会引起机体强烈的炎症反应，同时能保护机体的正常组织不受影响，因此开发研究诱导肿瘤细胞凋亡的药物成为目前研究的热点与趋势。细胞凋亡通路主要有线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路，Caspase-3死亡受体途径和线粒体途径的共同通道，Caspase-3的表达增加可以标志着细胞内的凋亡机制已经启动〔1〕。而IAPs家族的新成员Survivin是目前发现的最强的凋亡抑制因子之一，也是细胞周期调节基因，它能直接或间接地抑制凋亡终末效应蛋白Caspase-3与Caspase-7的活化而阻止细胞凋亡;通过与纺锤体纤维结合，间接抑制Caspase对纺锤体的水解，有利于保护有丝分裂的完整性抑制细胞的凋亡。

AS2O3是中药砒霜的主要成分，已用于临床急性早幼粒白细胞病的治疗，对多种实体瘤也已从体外细胞、动物移植瘤到临床试验都观察到明显的疗效〔2～5〕。但AS2O3抗肿瘤机制复杂而广泛，目前其抗肿瘤机制尚未完全明确，与一般的化疗药物相比，AS2O3能只杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞〔6〕，主要与诱导肿瘤细胞凋亡有关〔7〕，其机制可能是通过开放线粒体通透性转运孔道、破坏线粒体跨膜电位、改变胞质钙离子浓度及氧化还原电位、活化Caspase家族、下调Survivin、Bcl-2活性等。已有研究证实AS2O3可诱导肺癌耐药细胞凋亡〔8〕，但高剂量AS2O3能对正常细胞产生细胞毒作用，从而限制了AS2O3治疗肺癌方面的应用。目前以AS2O3为基础的联合化疗成为研究的热点。本研究显示AS2O3能抑制Survivin的表达，上调Caspas-3的表达，与剂量呈正相关，抑制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡。

VitC是具有多种生物学功能的水溶性己糖衍生物，它既是细胞保护剂，同时也可能是AS2O3抗肿瘤的协同剂，其机制可能是通过氧化作用进一步减少肿瘤细胞内本来就缺乏的过氧化物酶，并增加过氧化氢的产生〔9〕，从而作用于pro-Caspase-3激活Caspase-3诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。有体外实验证明Vit C能抑制肺癌A549细胞的增殖，及诱导其凋亡〔10〕，但在本实验中单用临床用药量Vit C对移植瘤无明显的抑制作用，这可能与药物的血药浓度，半衰期，及到达肿瘤组织的药物量有关。此外Vit C在抗肿瘤应用上存在争议，一方面Vit C能清除氧自由基，修复DNA损伤，增强机体免疫功能及诱导细胞凋亡，但高剂量Vit C可将脂质过氧化物降解为内源性的基因毒性物质，也可导致过氧化亚硝酸盐诱导DNA毒性及单股DNA链的断裂，可能对细胞产生毒性作用及导致细胞的癌变〔11〕。因此Vit C被建议作为肿瘤辅助治疗药物。本研究显示单用Vit C对Survivin及Caspase-3作用不明显，对移植瘤没有明显的抑制作用。而Vit C联合低剂量AS2O3抑制Survivin表达及上调Caspas-3的作用较高剂量AS2O3更强，抑制肿瘤的生长的效果更好。提示Vit C可能阻止Survivin与Caspase-3的结合，影响肿瘤细胞的凋亡过程，它与AS2O3联用能更有效地促进耐药性肺癌细胞的凋亡。本研究为以AS2O3为基础的肺癌治疗方案在临床上的运用提供了一定的理论依据。

1 Earnshaw WC，Martins LM，Kaufmanri SH.Mammalian caspases:structure，activation，substrates，and functions during apoptosis〔J〕.Annu Rev Biochem，1999;68:383-424.

2 Kang JH，Shi YM，Zheng RL.Effect of ascorbic acid on human hepatoms cell proliferation and redifferentiation〔J〕.Pharmacol Sin，1999;20:1019-24.

3 张兴荣，蔡洪培，邓志华，等.三氧化二砷对胃癌裸鼠腹腔转移瘤的形成及其机制的初步研究〔J〕.癌症，2002;20(4):477-9.

4 Dai J，Weinberg RS，Waxman S，et al.Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arsenic trioxide through modulation of the glutathione redox system〔J〕.Blood，1999;93:268-77.

5 黄守国，孔北华，杨瑞芳，等.三氧化二砷抑制人卵巢癌裸鼠腹腔转移瘤的形成及其机制的初步研究〔J〕.癌症，2002;21:401-4.

6 邓 志，蔡洪培，李 石，等.三氧化二砷对正常肝细胞及肝癌细胞株的影响〔J〕.中华消化杂志，1999;19(4):277.

7 徐洪雨，高媛媛，武俏丽，等.三氧化二砷抑制人肝癌细胞株增殖和诱导凋亡作用〔J〕.世界华人消化杂志，2000;8:1233-7.

8 冯觉平，孔庆志，黄 涛，等.三氧化二砷对肺腺癌耐药细胞A549/R耐药性的影响〔J〕.中华实验外科杂志，2006;23(2):201-3.

9 Zheng QS，Zhang YT，Zheng RL.Ascorbic acid induces redifferentiation and growth inhibition in human hepatoma cells by increasing endogenous hydrogen peroxide〔J〕.Pharmazie，2002;57(11):753-577.

10 曾锦荣，谭 宁，翟彭勇，等.维生素C对AS2O3抑制肺癌A549细胞增殖、诱导细胞凋亡作用的影响及机制〔J〕.山东医药，2010;50(3):7-9.

11 LEE SH，OE T，BLAIR IA.Vitamin C induced de-composition of lipid hydroperoxides to endogenous geno-toxins〔J〕.Science，2001;292(5524):2083-6.