9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶对小鼠学习记忆的影响

王 刚 张利敏 侯志飞 相会欣 牟飞飞 李 洪

(河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北 石家庄 050031)

乙酰胆碱酯酶 (AChE)抑制剂通过抑制AChE的活性，恢复乙酰胆碱 (ACh)的正常水平，提高胆碱能神经元的兴奋性，从理论和临床上均已证明是有效的治疗阿尔茨海默病(AD)的药物〔1〕，但因为目前多数的该类药物选择性低，在抑制AChE的同时，对存在于外周组织中的丁酰胆碱酯酶(BuChE)亦产生抑制作用，从而引起外周拟胆碱样的不良反应〔2〕。因此，此类药物的研发是当前新药开发的热点〔3〕。9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶是我校新合成的AChE抑制剂，本文旨在观察该药对AD模型小鼠的学习记忆的影响，并通过探讨其对AChE和BuChE活性影响分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠，雌雄各半，清洁级，体重18～22 g，由河北省实验动物中心提供，试验期间饲养于专用饲养盒内，每盒5只，自由进食饮水。

1.2 药物、试剂与仪器 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶由我校药物化学教研室合成，批号:060803，纯度为98.9%;东莨菪碱(上海禾丰制药有限公司产品，批号0710019);AChE，BuChE活力检测试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物研究所);UV-2000紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);小鼠Morris水迷宫(中国医学科学院药物所研制)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和给药方法 小鼠适应性饲养2 d后按随机分为对照组、模型组和9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶给药组(20、10和5 mg/kg剂量组)，每组10只，雌雄各半。于给药前将受试物溶于蒸馏水，按0.2 ml/10 g容积进行灌胃，每天1次，连续10 d，空白对照组及模型对照组灌胃给予等体积的蒸馏水。于第7天给药后1 h，除空白对照组外，其余各组给予氢溴酸东莨菪碱造模，在Morris水迷宫学习训练前15 min小鼠腹腔注射1.5 mg/kg氢溴酸东莨菪碱，给药容积为0.2 ml/10 g，每天1次，共4次。

1.3.2 Morris水迷宫试验〔4〕每天对动物进行训练，连续4 d，训练时将小鼠放入水迷宫中自由游泳2 min以适应环境，每天训练2次，间隔10 min，每次分别从2个不同入水点将小鼠面向容器壁放入水中游泳，记录小鼠入水后爬上平台所用的时间(潜伏期)，若小鼠在90 s内不能找到水下平台，其潜伏期按90 s记录。最后1 d正式试验，记录小鼠入水后爬上平台的潜伏期。

1.3.3 生化指标测定 行为学测试完成后，各组小鼠摘眼球取血，并于4℃、3 500 r/min离心15 min，取上清后－20℃保存备用。处死小鼠，在冰块上快速分离大脑组织，以9倍体积的生理盐水将所取脑组织制成10%组织匀浆，将匀浆于4℃，3 500 r/min离心15 min后取上清，－20℃保存备用。分别按试剂盒说明书测定血清BuChE活性及脑组织中AChE的活性，以考马斯亮蓝试剂盒测定脑组织蛋白含量，AChE的活性以每毫克蛋白表示。

2 结果

2.1 各组小鼠学习记忆能力比较 Morris水迷宫试验结果显示，随着训练次数的增加，各组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短。与对照组相比，模型组小鼠找到平台潜伏期显著延长(P＜0．01)，受试物20、10 mg/kg组与模型组比较明显缩短潜伏期(P ＜0．01或 P ＜0．05)，5 mg/kg组仅有缩短趋势，但与模型组比较无统计学意义(P＞0．05)。见表1。

2.2 生化指标测定结果 与对照组相比，模型组脑组织AChE活性显著升高(P＜0．01)，与模型组相比，受试物高、中剂量组AChE活性显著下降(P＜0．01或P＜0．05);与对照组相比，模型组血清中BuChE活性显著升高(P＜0．05)，受试物各剂量组BuChE活性与模型组比较无显著差异(P＞0．05)。见表2。

表1 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶对东莨菪碱致学习记忆障碍小鼠Morris水迷宫潜伏期的影响(± s，n=10)

表1 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶对东莨菪碱致学习记忆障碍小鼠Morris水迷宫潜伏期的影响(± s，n=10)

与对照组比较:1)P ＜0．05，2)P ＜0．01;与模型组比较:3)P ＜ 0．05，4)P ＜0．01;下表同

组别 剂量(mg/kg) 第1天 第2天 第3天 第4天对照组 － 60．3 ±20．7 48．2 ±15．4 20．8 ±8．9 15．0 ±9．2模型组 － 87．4 ±19．3 75．2 ±20．01) 68．1 ±12．72) 64．2 ±19．52)受试物 20 81．2 ±15．5 60．0 ±13．1 32．2 ±15．44) 28．9 ±9．84)10 81．9 ±12．2 66．5 ±19．4 48．9 ±18．03) 39．9 ±15．44)5 86．4 ±20．5 66．9 ±19．7 60．3 ±14．8 54．0 ±16．3

表2 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶对东莨菪碱致学习记忆小鼠血清BuChE活性及脑组织AChE活性的影响(± s，n=10)

表2 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氢吖啶对东莨菪碱致学习记忆小鼠血清BuChE活性及脑组织AChE活性的影响(± s，n=10)

组别 剂量(mg/kg) BuChE(U/ml) AChE(U/mg)对照组 － 2．48 ±0．32 0．58 ±0．09模型组 － 2．89±0．271) 1．32±0．122)受试物 20 2．58 ±0．28 0．78 ±0．133)10 2．73 ±0．19 1．10 ±0．194)5 2．70 ±0．37 1．23 ±0．18

3 讨论

学习记忆和思维是大脑的高级活动，记忆力下降是构成各种痴呆症的早期和主要症状。中枢胆碱能系统是学习记忆的重要生理基础，东莨菪碱作为小鼠记忆障碍的诱导剂，能破坏大脑皮层和海马以及隔区等部位的胆碱能传递，降低体内抗氧化酶的活性，导致自由基水平的升高，破坏学习和记忆等高级机能，可模拟临床胆碱能功能低下导致痴呆，被广泛用于抗痴呆药物的评价〔5〕。本试验结果表明，小鼠连续腹腔注射东莨菪碱7 d，可以导致小鼠的学习记忆障碍，而给予胆碱酯酶抑制剂9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氢吖啶可以提高 AD 模型小鼠的学习记忆能力，并且可以剂量依赖性提高模型小鼠脑组织中AChE的活性，该结果可以为其进一步的开发提供理论依据。

BuChE又称血清胆碱酯酶或假性胆碱酯酶，广泛分布于血清、造血细胞、心、肺等外周组织中，当抑制该酶可引起外周的拟胆碱样的不良反应。本试验结果表明，9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氢吖啶在抑制脑 AChE 活性的同时，对外周丁酰胆碱酯酶无影响，这提示其对外周的胆碱能系统影响较小，从而可以减小或避免以往低选择性胆碱酯酶抑制剂所带来的外周胆碱样不良反应。然而，除东莨菪碱致小鼠记忆损伤模型外，9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氢吖啶的作用需进一步在其他AD动物模型上进行考察，并且其作用确切机制以及最终信号通路尚待进一步探讨。

1 Swerdlow RH．Is aging part of Alzheimer＇s disease，or is Alzheimer＇s disease part of aging〔J〕?Neurobiol Aging，2007;28(10):1465－80．

2 喻东山．胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔采莫氏病〔J〕．四川精神卫生，2010;23(1):54－7．

3 Musiał A，Bajda M，Malawska B．Recent developments in cholinesterases inhibitors for Alzheimer＇s disease treatment〔J〕．Curr Med Chem，2007;14(25):2654－79．

4 黄晓舞，刘睿婷，吕秋军．广霍香醇对东莨菪碱致记忆障碍小鼠学习记忆功能的影响〔J〕．中草药，2009;40(9):1431－3．

5 Zhang J，Zhu D，Sheng R，et al．BZYX，a novel acetylcholinesterase inhibitor，significantly improved chemicals－induced learning and memory impairments on rodents and protected PC12 cells from apoptosis induced by hydrogen peroxide〔J〕．Eur J Pharmacol，2009;613(1－3):1－9．