原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系

南栗岩 齐 玲 肖振晶 赵庆旭 王 伟 于洪泉 (吉化集团公司总医院药剂科，吉林 吉林 30)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员，作为肿瘤治疗的新药，在美国已进入临床Ⅱ期试验阶段〔1〕。但由于在肿瘤治疗研究中，TRAIL一直存在治疗抵抗，因此，本文对原代培养的恶性胶质瘤细胞进行研究，通过观察TRAIL的两种受体——死亡受体(DR)4、DR5在恶性胶质瘤细胞中的表达，探讨在原代培养肿瘤细胞中存在的TRAIL抵抗问题。

1 材料与方法

1.1 细胞培养〔2〕取新鲜人脑胶质瘤组织(吉林大学第一医院提供，病理诊断为Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤)。将组织剪成小块(1 mm×1 mm)，置于离心管中，加入0.25%胰酶，37℃恒温水浴中孵育30 min，离心后弃上清，培养液重悬细胞，苔盼蓝计数活细胞，加入10%DMEM/F12(Gibco)培养液，以1×106个/75 cm2密度接种细胞，将培养瓶置入37℃、5%CO2孵箱、饱和湿度下进行培养，隔日换液，1∶3传代，获得3株恶性胶质瘤细胞株(GC417、GC321、GC125)。

1.2 免疫印迹检测恶性胶质瘤细胞中神经分裂症断裂基因(DISC)成分的表达〔3〕将细胞培养3 d，待细胞生长90%左右，弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤细胞，弃PBS，0.25%胰酶消化，将细胞收集于1.5 ml离心管中，3 000 r/min离心5min，弃上清。PBS充分洗涤细胞，离心弃上清，每个样品加入50 μl的细胞裂解液，细胞充分裂解后，12 000 r/min 4℃离心15 min，上清移于另一管中，弃沉淀，Braford法检测样品蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)跑胶分离样品，4℃转膜封闭后，加入相应一抗〔兔抗人死亡受体(DR)5多克隆抗体;兔抗人DR4多克隆抗体;兔抗人β-actin多克隆抗体;1∶1 000〕4℃孵育过夜。加入相应的二抗，室温、避光孵育1 h，胶片曝光拍照。

2 结果

Western印迹结果显示，在三株原代培养的恶性胶质瘤细胞株中，死亡受体DR5表达略有不同，GC321表达量明显高于其他两株细胞，GC125和GC417表达则明显减少。在三株细胞中DR4的表达差别不明显。见图1。

图1 恶性胶质瘤细胞表达DR5、DR4情况

3 讨论

TRAIL自发现至今，一直处于相对较热的研究状态。作为肿瘤坏死因子超家族中的一员，TRAIL可由体内的免疫系统细胞正常表达，并具有天然的肿瘤杀伤活性，对正常细胞无明显毒性作用〔1〕。国内外已进行了很多关于TRAIL的研究，但现在困扰科研人员的难题之一就是其在多种肿瘤研究过程中出现TRAIL抵抗现象。脑肿瘤是病死率最高的肿瘤之一，恶性肿瘤占70%以上〔4〕。很多胶质母细胞瘤细胞株及原代培养的胶质母细胞瘤对TRAIL诱导凋亡存在抵抗，并且发表许多关于抵抗方面的报道〔5～7〕。到目前为止，对于TRAIL在脑胶质瘤细胞中产生抵抗的机制还不十分清楚，国内对此研究较少，因此，本实验对原代培养的恶性胶质瘤表达DR5、DR4情况进行研究，初步探讨其表达与细胞凋亡之间的关系。

TRAIL受体有五种，包括:DR-DR4、DR5，诱捕受体(decoy receptor，DcR)-DcR1、DcR2 及护骨素(osteoprotegerin，OPG)。DR4、DR5均为Ⅰ型膜蛋白，含有两个结构域，一个胞外富含半胱氨酸区域(cysteine-rich domain，CRD)，它与 TRAIL结合;另一个胞浆内的死亡结构域(death domain，DD)，能够传递死亡信号，诱导肿瘤细胞凋亡。DcR1、DcR2及OPG与DR相似，但缺乏功能性细胞内死亡结构域，均不能传递死亡信号。正常组织和细胞中表达DcR1、DcR2，与DR竞争结合TRAIL，所以TRAIL对正常的组织和细胞无明显毒性作用〔8，9〕。DR4和 DR5与TRAIL特异性结合后，可通过胞浆内的 DD激发并传递凋亡信号。

本实验采用原代培养的胶质母细胞瘤细胞株GC321、GC417、GC125，这三株细胞对TRAIL的反应性不同，GC321敏感，GC417不敏感，而GC125介于前两者之间。Western印迹显示，在三株原代培养的恶性胶质瘤细胞株中，DR5表达略有不同，GC321表达量明显高于其他两株细胞，GC125和GC417表达则明显减少;DR4的表达差别不明显。这说明可能DR5表达与原代培养的恶性胶质瘤细胞对TRAIL的敏感性相关，但是否还有TRAIL传导通路中其他因素影响细胞发生凋亡，还需要深入研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mu lligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 齐 玲，金 宏，丁丽娟，等.脑肿瘤干细胞的培养及生物学特性研究〔J〕.中国实验诊断学，2011;15(2):227-8.

3 齐 玲，于洪泉，丁丽娟，等.Caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗TRAIL诱导凋亡中的作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011;37(4):612-6.

4 Sathornsumetee S，Reardon DA，Desjardins A，et al.Molecularly targeted therapy for malignant glioma〔J〕.Cancer，2007;110(1):13-24.

5 Bellail A，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

6 Xiao C，Yang BF，Asadi N，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand-induced death-inducing signaling complex and its modulation by c-FLIP and PED/PEA-15 in glioma cells〔J〕.J Biol Chem，2002;277(28):25020-5.

7 Song JH，Bellail A，Tse MC，et al.Human astrocytes are resistant to Fas ligand and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis〔J〕.J Neurosci，2006;26(12):3299-308.

8 Griffith TS，Anderson RD，Davidson BL，et al.Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis〔J〕.J Immunol，2000;165(5):2886-94.

9 Almasan A，Ashkenazi A.Apo2L/TRAIL:apoptosis signaling，biology，and potential for cancer therapy〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2003;14(3-4):337-48.