依那普利抗心肌纤维化的作用及机制

李志丹 曲晓峰 娄长芹 (北华大学第二附属医院神经内科，吉林 吉林 30)

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是心肌对多种疾病包括高血压、负荷增加、心肌梗死、心律失常的适应性反应，是心输出量增加的代偿性反应，但持续MF能引起心室壁僵硬、心脏顺应性降低、心室舒张功能障碍。MF是心血管疾病病死率和发病率的独立危险因素。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能够诱导人体补体因子B(CFb)的增殖及其胶原合成，在肥厚型心肌病的病理损害中起重要作用。依那普利(Ena)在临床上用于治疗高血压、心肌肥厚、心力衰竭等疾病。近年发现其具有抗MF作用〔1〕，但对其机制研究较少。本实验通过观察Ena抗AngⅡ/异丙肾上腺素(Iso)诱导大鼠CFb增殖及纤维化作用，观察其对胶原合成及形态学指标的影响，探讨其在抗MF中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 实验动物:出生1～3 d的新生乳鼠和60只体重200～220 g Wistar大鼠，雌雄不限，本校实验动物中心提供;胰蛋白酶:宝泰克生物试剂;AngⅡ:Sigma;Iso:批号3E0002，济南科汇制药有限公司;四氮唑盐(MTT)、碘化丙啶、羟脯氨酸(Hyp)试剂盒:南京建成生物公司;Ena购自江苏常州制药厂，批号0601151;IMDM培养基:HyClone Utah公司;胎牛血清(FCS):常州四季青;Heraeus型CO2培养箱;SUNRISE TECAN FO39300型自动酶联检测仪;日本Olympus倒置显微镜;超净工作台。

1.2 方法

1.2.1 CFb原代培养及鉴定 出生1～3 d的Wistar大鼠心室，胰酶消化，收集细胞，置于含100 ml/L FCs的IMDM培养液中，在50 ml/L CO2、37℃、饱和湿度条件下培养60～90 min。采用差速贴壁法分离CFb，加入含100 ml/L FCs的IMDM继续培养。经鉴定为所需的CFb，纯度达98%，生长近融合时按1∶3传代，实验采用2～4代细胞。

1.2.2 分组及给药 分为五组，对照组，AngⅡ组(AngⅡ10-7mol/L);Ena(10-7，10-6，10-5mol/L)三个剂量组。参照Rona等方法，模型组和各给药组首次背部皮下注射 Iso 20.0 mg/kg，第二日背部皮下注射 Iso 10.0 mg/kg，第三日予5.0 mg/kg，第四日予3.0 mg/kg，连续1 w，共10 d。自由进食，给水。各给药组第二日开始灌胃(ig)给药，每日一次，连续14 d，造模和给药间隔时间4 h以上。对照组皮下注射等量生理盐水，模型组和对照组等容积蒸馏水灌胃，末次给药后禁食24 h，第15天处死动物。

1.2.3 MTT比色法检测心肌成纤维细胞的增殖活力 各组细胞接种于96孔培养板，每组8复孔，于培养结束前4 h加入5 g/L MTT 10 μl，待形成蓝紫色的结晶沉淀后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl使沉淀降解，在酶联免疫检测仪上490 nm波长处检测光吸收值(A值)，用只加培养液不加细胞的空白孔调零。

1.2.4 Hyp测定 分组同MTT法，换用24孔培养板，药物作用48 h。操作步骤严格按试剂盒说明;取心尖心肌组织100 mg，生理盐水洗净后剪碎，加水解液1 ml混匀，放入带盖的玻璃磨口试管中，加盖后，95℃或沸水浴水解20 min，按照说明依次加入试剂，3 500 r/min离心10 min，取上清液1 ml检测，按照说明书测定Hyp含量，所得值/0.134即为心肌中胶原蛋白的含量。

1.2.5 心肌组织形态学观察 取左室近心尖1/2处心肌下部组织，分别行苏木素-伊红(HE)染色，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察心肌组织病理学变化。

1.2.6 心室重量指数测定 大鼠称重处死，取出心脏，剔除心房、大血管、心外膜脂肪组织及瓣膜，生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称取心脏重量(HW)、心室重量(VW)、左室重量(LVW)，用心室重量除以大鼠体重计算出心室/体重指数，以心重(mg)/体重(g)表示。

1.3 统计学分析 使用SPSS统计软件，所有实验结果以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 倒置显微镜下CFb生长形态的改变 各处理组作用24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。对照组细胞胞体较大，胞浆丰富，呈梭形;AngⅡ组增生活跃，呈编织状生长，细胞生长密集;加入Ena后，细胞间隙逐渐增大，细胞体积缩小，透光度降低。见图1。

2.2 MTT法检测CFb的增值活力 AngⅡ组OD值(0.344 9±0.020 3)明显升高，与对照组(0.254 3±0.065 3)相比有显著性差异(P＜0.01)，可证实AngⅡ对CFb有促增殖作用。加入不同浓度的 Ena后，OD值显著低于 AngⅡ组(Ena 10-7、10-6、10-5mol/L 组 OD 值分别为 0.329 0 ± 0.030 4，0.287 3±0.025 0，0.220 6±0.056 0)，且呈剂量依赖性，与AngⅡ组相比有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。部分为局灶性或广泛片状分布，严重者坏死灶相连，累及心室壁全层，坏死处由心肌成纤维细胞取代。Ena干预组心肌损伤较AngⅡ组明显减轻，呈片状，主要位于心内膜下。见图2。

2.5 Ena对心室重量指数的影响 AngⅡ组HW/BW，低黏度指数(LVI)明显升高，与对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)，Ena三个剂量组均能降低 HW/BW、LVI水平，与Iso组比较，均不同程度地降低了HW/BW、LVI水平(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1 Ena对心室重量指数的影响

2.3 Hyp法检测CFb胶原蛋白含量 AngⅡ组 Hyp含量(2.37±0.18)与对照组(1.75±0.26)相比差异显著(P＜0.05);用药后，Hyp含量下降，随Ena浓度增加有明显的量效关系，与 AngⅡ组比较，Ena 10-7mol/L、10-6mol/L组(1.42±0.21，1.36±0.17)差异显著(P ＜0.05)，Ena 10-5mol/L组(1.21±0.16)差异非常显著(P＜0.01)。见图2。

图1 各组CFb生长形态变化(×100)

图2 各组大鼠MF病理改变(×400)

2.4 Ena对Iso诱导大鼠MF病理学改变的影响 光镜下HE染色可见对照组心肌肌纤维排列整齐，染色均匀一致;AngⅡ组心肌纤维断裂缺损，排列紊乱，坏死灶主要位于心肌内膜下，大

3 讨论

心脏由心肌细胞和间质细胞组成，间质90%以上是CFb。MF在心肌细胞肥大的同时，伴有间质CFb增殖及胶原分泌增加，其结果将引发心功能不全〔2〕。因此，CFb在MF发生过程中起着十分重要的作用。深入研究间质重构和CFb增殖的关系，采取有效措施预防和逆转MF，控制心脏重构，是基础及临床研究的热点。

MF表现为心肌成纤维细胞增殖及其分泌的胶原增多，同时伴有心肌胶原成分的不成比例增加。MF引起的心室重构包括实质重构和间质重构，前者表现为心肌细胞病理性肥大、变性、坏死等，后者主要表现为心肌间质纤维化及细胞外基质胶原网的含量变化和组成改变〔2〕。

现今塑造MF模型的方法很多，离体实验多采用AngⅡ，在体实验国内外较为常用的方法为皮下注射大剂量Iso，其机制主要是增加了循环系统和心肌局部的AngⅡ浓度，从而导致MF的发生〔3〕，该模型具有MF改变出现早、效果稳定持久、简单易行、费用低廉等特点，成为研究MF的常用实验方法。Iso作为β受体激动剂，可以增加心肌收缩力和收缩频率，本身还可促进环磷酸腺苷生成和糖原合成增加，从而促进心肌细胞总蛋白和非收缩蛋白质合成，致使心肌细胞肥大，胶原纤维增生。连续用β受体激动剂Iso刺激大鼠能引起大鼠心肌肥厚和MF〔4〕，其机制为激活 β-肾上腺素能受体(β-AR)、肾素-血管紧张素醛固酮系统(RAAS)，并可能通过多种细胞信号转导途径影响纤维化过程。研究发现，Iso能够通过整体激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、核转移因子(NF)-κB、Janus激酶/信号转导和转录激活(JAK/STAT)等多种信号途径引起肥厚性MF，但其详细机制尚未明了。

Hyp是机体胶原蛋白的主要成分之一，在正常胶原蛋白中含量约13.4%，在弹性蛋白中含量极少，而在其他蛋白则不存在。因此，组织中Hyp含量可作为衡量其胶原组织代谢和判断纤维化程度的重要指标。HW/BW、LVI指数目前已被许多实验用来作为观察心室纤维化的重要指标〔5〕，实验中大鼠心室胶原蛋白浓度明显增加。本实验结果显示，连续给大鼠背部皮下注射Iso，其HW/BW和LVI值明显升高，提示使用Iso后大鼠心肌间质纤维化明显。而用Ena治疗后，各剂量组大鼠的HW/BW、LVI显著降低，提示Ena能减轻心肌肥厚，抑制心肌间质细胞胶原含量增加而改善心肌重构，与文献报道一致〔6〕。

AngⅡ/Iso可以通过激活RAAS引起MF，导致心肌肥大、变性、坏死、CFb增殖伴随ECM中大量胶原纤维堆积、MF，HW/BW、LVI、Hyp增多，Ena通过抑制 AngⅡ生成，保护缓激肽(BK)活性，降低上述各指标，从而逆转或减少MF发生，但其详细机制有待于在细胞水平上进一步研究

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