αvβ6－ERK直接通路参与去甲斑蝥素诱导HT－29结肠癌细胞凋亡*

张 琦， 胡燕燕， 彭 程， 牛卫博， 刘恩宇， 贺兆斌， 赵传宗， 牛 军

(1山东大学第二医院血液肿瘤科，山东 济南 250033;山东大学齐鲁医院2干部保健科，3肝胆外科，山东 济南 250012)

整合素是细胞表面黏附分子家族成员，由α和β 2种亚基通过非共价键连接而成，是一类阳离子依赖的跨膜糖蛋白受体，其中αvβ6又是一种特殊的上皮细胞限制性整合素亚型。整合素αvβ6的主要配体是纤维连接蛋白，在正常健康成人上皮组织中无法测到β6 mRNA和蛋白的表达［1］;但是却出现在胚胎形成、损伤修复和一系列上皮源性肿瘤之中［2］。

结肠癌是国内临床最常见的一类消化道恶性肿瘤，其发病率呈现逐年升高的趋势［3，4］。外科手术是治疗结肠癌最有效的手段，但是术后肿瘤的局部复发和远处转移仍是影响其预后的关键性因素［5］。因此，术后早期进行化疗是目前改善结肠癌预后的较好选择。FOLFOX4作为治疗晚期转移性结肠癌的一线化疗方案［6］，国内多家医院通过多中心双盲临床观察证实，将去甲斑蝥素和FOLFOX4化疗方案联合应用治疗晚期结肠癌较单独应用FOLFOX4方案不但近期疗效好、不良反应轻，而且中位生存时间明显延长，生活质量显著提高［7，8］。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是由呋喃和马来酸酐进行 Diels－Alder加成反应并催化加氢后获得的新型人工合成化合物。长期以来关于去甲斑蝥素如何发挥抗癌作用有各种解释，但尚无明确结论。

我们的前期研究证实，αvβ6的表达与肿瘤的恶性生物学行为密切相关，参与调控其中的众多环节。本研究旨在这些基础上探索NCTD的抗癌机制。

材料和方法

1 细胞株和试剂

人结肠癌HT－29细胞株购自美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection，ATCC);鼠抗人αvβ6整合素胞外区单抗 R6G9(IgG2a)、鼠抗人αvβ6整合素功能性单抗10D5(IgG2a)、鼠抗人αvβ5整合素功能性单抗P1F6(IgG1)及鼠抗人αvβ3整合素功能性单抗LM609(IgG1)均购自Chemicon;标准IgG2a和IgG1抗体购自Dako;抗ERK(extracellular signal－related kinase，ERK)、抗 p－ERK(phosphorylated ERK)、抗 JNK(c－Jun N －terminal kinase，JNK)、抗p－JNK(phosphorylated JNK)、抗p38以及p－p38(phosphorylated p38)抗体均购自Santa Cruz;Hoechst 33258细胞凋亡试剂盒购自中国凯基生物技术公司;明胶琼脂糖珠4B购自Amersham Pharmacia;NCTD(分析纯)购自北京第四制药厂。

2 方法

2.1 Hoechst 33258染色 分别吸取经60 μmol/L NCTD处理12 h的HT－29细胞悬液和对照组(未处理)细胞悬液，滴于载玻片上，醋酸－乙醇固定。冰磷酸缓冲液冲洗2遍，每次5 min;4℃下，4%甲醛固定10－15 min;冰磷酸缓冲液冲洗2遍，每次5 min;加入Hoechst 33258荧光染料，室温下避光染色15 min;冰磷酸缓冲液冲洗3遍，每次5 min;避光晾干，水溶性封片剂封片，在荧光显微镜(Olympus)下观察细胞凋亡情况。

2.2 流式细胞术检测细胞表面蛋白质的表达 用胰酶收集单层培养的细胞，羊血清4℃封闭10 min。PBS 漂洗1 次，αvβ6、αvβ5 和 αvβ3 单抗 R6G9、PIF6和LM6094℃孵化20 min，再用PBS漂洗2次，用标记了藻红蛋白的Ⅱ抗羊抗鼠IgG(60 mg/L)4℃染色20 min，接着用PBS漂洗2次，取0.5 mL PBS重悬液进行流式细胞术分析。测定各细胞表面整合素αvβ6、αvβ3 和 αvβ5 的表达情况。

2.3 Western blotting检查蛋白质表达 分别收集对照组及处理组细胞，将其裂解于200 μL含有蛋白酶抑制剂(100 mg/L PMSF，2 mg/L Aprotitin)的裂解液中［1%Triton X －100，50 mmol/L Tris－HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4］，4 ℃ 裂解 40 min，15000 r/min离心20 min，取上清，Bradford法进行蛋白定量。与3×样品缓冲液混合，煮沸5 min。将样品在10%的SDS－聚丙烯凝胶中进行电泳3 h，然后转印至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入Ⅰ抗，4℃过夜。TTBS洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温下作用30 min，ECL法显色。

2.4 免疫共沉淀 4℃下，等量的NCTD处理组细胞和对照组细胞裂解液用αvβ6单克隆抗体R6G9孵育过夜;细胞裂解液高速离心(10000×g，10 min);裂解液用兔抗鼠免疫球蛋白偶联的4B－琼脂糖小球处理2 h，间接将免疫沉淀析出;免疫沉淀蛋白用RIPA缓冲液洗涤3次;免疫沉淀蛋白在非衰减条件下用7.5%SDS－PAGE分析。

3 统计学处理

百分率比较用χ2检验，计量资料以均数±标准差()表示，两样本均数比较采用成组设计的t检验，成组设计的多样本均数比较采用单因素方差分析，用SPSS 16.0软件进行统计分析。

结 果

1 NCTD诱导人结肠癌HT－29细胞凋亡

取预先用60 μmol/L NCTD处理的HT－29细胞悬液和未经NCTD处理的细胞悬液，Hoechst 33258染色，荧光显微镜观察细胞凋亡情况。未处理组HT－29细胞，核染色均一、明亮，见图1A;而NCTD处理组，细胞凋亡明显增加，蓝色荧光显著增强，细胞核内有凝聚态染色质，部分细胞内凋亡小体出现，细胞呈现典型的凋亡态特征，见图1B。任意选取10个视野，每个视野计数200个细胞，未处理组细胞凋亡率为1.45% ±0.67%，而NCTD处理组细胞凋亡率为35.60% ±1.84%，两者对比有显著差异(P＜0.01)，见图1C。

2 NCTD抑制HT－29细胞表达整合素αvβ6

预先用 20 μmol/L、40 μmol/L 和 60 μmol/L NCTD处理细胞12 h(NCTD未处理组作为空白对照)，然后用流式细胞仪检测整合素 αvβ6、αvβ5 和αvβ3的表达情况。结果显示，整合素αvβ6荧光密度值(intensity fluorescence，IF)随NCTD浓度增加而依次降低(113±3、85±2、54±2、29±1)，差异显著(P＜0.01)。随 NCTD 浓度增加，整合素 αvβ3和αvβ5 表达情况未见明显变化(P ＞0.05)，见图2。

3 MTT检测整合素功能阻断抗体对HT－29细胞生长的影响

预先用针对整合素 αvβ3、αvβ5 和 αvβ6 的功能阻断抗体LM609(10 mg/L)、FIF6(10 mg/L)和10D5(10 mg/L)封闭细胞2 h，然后再经20 μmol/L NCTD处理12 h，标准单克隆抗体IgG2a和IgG1作为阴性对照。实验证实，只有αvβ6功能阻断抗体10D5能够明显抑制结肠癌 HT－29细胞生长(P＜0.01);当NCTD与10D5联用时，此种抑制效应明显增强(P＜0.01)，而整合素 αvβ3 和 αvβ5 的单克隆抗体 LM609和FIF6则无明显抑制细胞生长的能力(P＞0.05)，见图3。

4 Western blotting检查去甲斑蝥素对人结肠癌HT－29细胞丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

预先用 0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和 60 μmol/L NCTD处理细胞24 h、36 h和48 h，然后进行Western blotting分析。结果显示，经NCTD处理后，细胞内ERK、JNK、p－JNK、p38和p－p38水平无明显变化。只有p－ERK含量随NCTD浓度增加或作用时间延长而逐渐降低，见图4A，呈现出明显的时间－剂量相关性，见图4B、C。表明NCTD对ERK的磷酸化过程有明显的抑制作用(P＜0.05)。

5 免疫共沉淀实验检测NCTD对HT－29细胞αvβ6－ERK直接连接的影响

HT－29细胞经40 μmol/L NCTD处理24 h后(未处理组设为阴性对照)，用抗αvβ6单克隆抗体R6G9析出免疫沉淀蛋白，再用抗ERK单克隆抗体(6G11)及抗p－ERK单克隆抗体(12D4)结合免疫沉淀蛋白，见图5。上层凝胶电泳图显示，用抗ERK抗体或抗p－ERK抗体可从未处理组的免疫沉淀中析出ERK或p－ERK，表明未处理组中αvβ6－ERK直接连接完整;下层凝胶电泳图显示，用抗ERK抗体或抗p－ERK抗体无法从处理组的免疫沉淀中析出ERK或p－ERK，表明处理组中αvβ6和ERK之间没有连接，NCTD具有干扰整合素αvβ6－ERK直接连接形成的作用。

讨 论

既往研究发现，整合素αvβ6可通过细胞黏附分子介导信号转导调控基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，在降解破坏基质和肿瘤侵袭转移中起重要作用。通过转基因诱导表达β6整合素，可使结肠癌细胞分泌 MMP －9增多，加速破坏细胞外基质［9］。αvβ6 可对丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路发挥直接调控作用，其中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)途径是整合素用于调控肿瘤细胞生长、侵袭和转移的主要通路。我们前期研究证实αvβ6的β链胞内功能段与ERK之间存在直接的生理性连接通路，阻断β6与ERK的结合位点则会抑制肿瘤生长。下调整合素β6亚基的表达可以抑制肿瘤细胞在体内的生长，并且抑制MAPK对血清刺激的反应活性。因此，αvβ6－ERK这一直接连接是细胞为了适应特定环境，专为高度恶性上皮肿瘤的发生发展、侵袭转移开通的一条直通信息高速公路［10］。

Figure 1.Apoptosis of HT －29 cells detected by Hoechst 33258 staining.A:control group，HT － 29 cells were not treated with NCTD;B:NCTD group，HT －29 cells were treated with 60 μmol/L NCTD for 12 h;C:comparison of the apoptotic rates between control group and NCTD group..n=3.＊＊P＜0.01 vs control group.图1 Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡

Figure 2.The suppression of β6 －subunit expression in HT －29 cells treated with NCTD.A:flow cytometry assay showed the suppression of β6 － subunit expression with NCTD treatment in HT －29 cells.B:the expression of the integrin αvβ6 in the HT －29 cells treated by NCTD was reduced，but the expression of αvβ5 and αvβ3 was not changed..n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图2 NCTD抑制人结肠癌HT－29细胞表达整合素αvβ6

Figure 3.MTT methods were used to detect the effects of function － blocking antibodies against αvβ6，αvβ5 and αvβ3 on HT －29 cells treated with or without NCTD.10D5 alone could inhibit HT－29 cells growth..n=3.＊＊P ＜0.01 vs other antibodies.This suppressing effects were strengthened when combining 10D5 with NCTD.△△P＜0.01 vs other antibodies+NCTD.图3 MTT检测整合素功能阻断抗体单独及联合去甲斑蝥素对HT－29细胞生长的影响

本研究中，我们发现NCTD有明显的诱导HT－29结肠癌细胞凋亡的作用，这与国外学者利用NCTD处理SAS细胞(人口腔鳞癌)、A375－S2细胞(恶性黑素瘤)和HeLa细胞(人宫颈癌)取得的结论相一致［11－13］。流式细胞分析证实，NCTD 能够抑制HT－29细胞表达整合素αvβ6，而且随着作用时间及浓度增大抑制效应逐渐增强。MTT实验也证实只有针对整合素αvβ6的功能性单抗10D5能够增强NCTD产生的细胞生长抑制效应，而整合素αvβ3的功能性单抗(LM609)和αvβ5的功能性单抗(P1F6)则无此效应。Western blotting分析表明，用NCTD处理HT－29细胞后仅有p－ERK表达水平降低，而且其降低程度与NCTD处理时间和作用浓度显著相关。细胞内ERK、JNK、p－JNK、p38和 p－p38表达水平则不受NCTD处理影响。免疫共沉淀表明，NCTD确实能够干扰ανβ6－ERK直接连接的形成。

Figure 4.Western blotting was used to detect the expression and the phosphorylation of mitogen activated protein kinases(MAPKs)in HT－29 cells treated with NCTD.A:Western blotting for MAPKs and p－MAPKs after treatment with various doses of NCTD(0，20，40，60 μmol/L)for 24，36，and 48 h;B，C:the level of p －ERK was decreased substantially by NCTD in a dose－and time－dependent manner..n=3.图4 Western blotting检测NCTD对HT－29细胞内MAPKs表达量及磷酸化程度的影响

Figure 5.Co－immunoprecipitation assay was used to detect the effects of NCTD on αvβ6 － extracellular signal－ regulated kinase(ERK)direct linkage in HT － 29 cells.Upper:HT －29 cells untreated without NCTD.Lower:HT － 29 cells treated with 40 μmol/L NCTD for 24 h.图5 免疫共沉淀实验检测NCTD对αvβ6－ERK直接连接的影响

综上所述，我们认为NCTD的核心药理学作用是通过降低HT－29细胞表达整合素αvβ6，阻碍ERK的磷酸化，干扰αvβ6－ERK直接连接形成，阻断了αvβ6介导的恶性生物学信号转导。NCTD通过αvβ6－ERK信号通路诱导HT－29人结肠癌细胞凋亡。

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