苹果桉组织培养技术探讨

刘 辉，陈家龙，李 宇，叶朝军，朱祝军

(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310029;2.温州科技职业学院，浙江 温州 325006)

桉树是桃金娘科(Myrtacae)桉树属(Eucalyptus)、杯果木属(Angophora)和伞房属(Corymbia)的众多树种的统称，包括808个种和137个亚种或变种。桉树具有生长快、材质好、轮伐期短、萌生能力强、适应性佳等特点，是世界上发展最快的短轮伐期工业原料林树种，目前已有100多个国家和地区进行了引种栽培。

除作为工业生产原料外，桉树还具有较高的观赏价值。观赏桉树是指树干、树冠、枝叶、花、果等部位形态优美独特，色彩艳丽。具有观赏价值的桉树，主要来自桉树属和伞房属，包含了100余种桉树。在澳大利亚等国家，观赏类桉树已广泛应用于庭院栽培、道路绿化等。桉树作为观赏植物具有管理容易、成本低廉、易于修剪和抗病虫害能力强等优点。随着社会经济的发展，国内开始重视观赏桉扦插繁殖及组织培养快速繁育。桉树是异花授粉植物，有性繁殖容易导致变异，难以保持物种的优良性状;用扦插方式进行繁殖，其繁殖速度无法满足生产的需要;采用组培快繁可使桉树保持其遗传稳定性，繁殖系数大，可满足生产需要，因而具有重要的意义。

自20世纪70年代末以来，澳大利亚、巴西、日本等国家已成功建立起一些桉树种类的组织培养快繁体系，并用于工厂化育苗，对优良品种的推广产生了积极的作用。但观赏桉树种类繁多，对于苹果桉的组培快繁技术研究在国内还未见报道。

作者以苹果桉(Eucalyptus bridgesiana)为材料，研究其外植体灭菌方法，探讨不同培养基和激素组合对苹果桉腋芽诱导萌发、增殖及生根效率的影响，为建立苹果桉组织培养快繁的技术体系提供提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2009年进行。供试材料为苹果桉，由武汉香草花卉有限公司提供，组织培养外植体是播种后1年生盆栽植株枝条。

1.2 方法

灭菌。以苹果桉树盆栽苗木上的半木质化枝条茎段做外植体。除去叶片和虫病斑，用自来水流水冲洗30 min。然后在超净工作台上用75%的乙醇消毒处理10 s，选用0.1%HgCl2溶液分别灭菌5，10，15 min，无菌水冲洗6次后将材料切成带顶芽或腋芽的长1.0 cm茎段接种到诱导培养基，10 d后统计污染率和褐化率。

培养基配方及激素处理。诱导培养基采用MS基本培养基和 WPM，并添加细胞分裂素6-BA(0.5 mg·L－1)和生长素 NAA(0.1 mg·L－1)的激素组合。增殖培养基为 MS基本培养基，添加6-BA和 NAA，6-BA浓度设 3个处理，即 0.5、1.0、1.5 mg·L－1，NAA 浓度为 0.1 mg·L－1。生根培养基:MS培养基添加不同浓度的NAA，浓度设置为0.5、1.0和1.5 mg·L－13个处理。

外植体培养方法。不定芽的诱导，将灭菌的茎段切成1.0 cm左右的带腋芽茎段，接种于诱导培养基上，每瓶接种2个外植体，重复15次，15 d后统计腋芽萌发效率;增殖培养，将诱导的腋芽新梢切下，转接到增殖培养基上，培养28 d后统计诱导出芽率;生根培养:选择长势较壮、高约2.0 cm的芽转接到生根培养基，培养28 d后统计诱导生根率。

培养条件。组织培养室的环境条件控制在温度为(25±2)℃，空气相对湿度70%左右，光周期为 12h/12h(白天/黑夜)，光照强度约为100 μmol·m－2·s－1。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时间对苹果桉茎段组培污染率的影响

由表1可知，用0.1%HgCl2溶液灭菌5 min的外植体在培养基上全部污染，随着灭菌时间的延长，污染率逐渐降低，但当灭菌时间达到15 min时，接种茎段容易发生褐化，褐化率达到40%。因此合适的灭菌时间应为10 min。

表1 0.1%HgCl2溶液灭菌时间对苹果桉茎段污染率的影响

2.2 不同基本培养基对茎段腋芽萌发诱导的影响

采用0.1%HgCl2溶液对苹果桉灭菌10 min后，无菌水冲洗6次。将材料切成带顶芽或腋芽长1.0 cm的茎段接种到诱导培养基，15 d后统计萌发率。结果表明，2种基本培养基 MS和WPM萌发率分别为40%和33%，MS培养基略好于WPM培养基(表2)。

表2 不同基本培养基对苹果桉茎段腋芽萌发诱导影响

2.3 不同6-BA浓度对无菌苗增殖的影响

将诱导的苹果桉腋芽新梢切下，转接到增殖培养基上，研究不同6-BA浓度对无菌苗增殖的影响。由表3可知，苹果桉树的无菌苗随着细胞分裂素浓度的增加，增殖系数呈上升趋势，6-BA浓度为0.5 mg·L－1时，增殖系数仅为1.4，浓度增加到1.0 mg·L－1时，增殖系数增加到2.1，但当浓度达到1.5 mg·L－1时部分小苗出现玻璃化现象。

表3 不同6-BA浓度对苹果桉无菌苗增殖的影响

2.4 不同浓度NAA对无菌苗生根的影响

如表4所示，当NAA浓度为0.5 mg·L－1时，生根率仅为33.3%，当浓度提高到1.0 mg·L－1时，生根率增加到80%，当 NAA为1.5 mg·L－1时生根率为56.7%，但基部形成大量的愈伤组织。

表4 不同NAA浓度对苹果桉无菌苗生根率的影响

3 小结和讨论

外植体茎段的年龄和生理状态是影响组织培养再生的重要因素。郭洪英等研究了不同年龄和不同木质化程度的桉树茎段根系发育情况，表明木质化程度较轻的幼嫩茎段具备较强的分裂和分化能力，衰老的茎段由于含有生根抑制物质，易发生根系发育不良的状况［1］。而徐南翔等人的研究则表明若芽组织过于幼嫩，在消毒过程中易受杀伤且褐化严重，因而不宜采用［2］。在本研究中采用了木质化中等的茎段组织，取得了较好的效果。

不同的基本培养基对于腋芽萌发诱导效果不同。宋建英等发现MS培养基对邓恩桉的诱导效果最好［3］，而郭洪英的研究表明采用1/2 H培养基并添加适量的活性炭诱导效果最佳［1］，这可能是由于不同的桉树品种需求不同所造成的。在本研究中采用的MS和WPM培养基效果基本相同，MS培养基萌发率略高，因此在后续试验中采用了MS基本培养基。

桉属树种的茎段必须通过外界物理或化学因素的刺激才能产生诱导根原基。根原基由皮部直接形成，或先形成愈伤组织后再产生根原基［4］，直接形成根原基具有生根时间短、根茎结合度高的优势。由愈伤组织分化形成的根，吸收水分能力差，成活率较低［5］。因此在茎段组织再生的过程中避免茎段愈伤组织的发生、促进皮部直接生根是桉树生根研究的关键。在本研究中我们分别采用6-BA和NAA用于腋芽的增殖和根系的诱导。采用1.0 mg·L－1的 NAA，生根率达到80%，同时也能避免愈伤组织的形成。这与我们此前在圆叶桉中的研究类似［6］。

桉树组织培养体系的建立涉及到的因素较多，如茎段的筛选、基本培养基的选择、激素配比的优化等，还需进一步研究优化方案，提高效率。

［1］郭洪英，陈炙，杨晓蓉，等．影响桉树组培苗根系发育关键因子的研究［J］．四川林业科技，2008，29(1):20－26.

［2］徐南翔．桉树组织培养育苗技术的研究［J］．吉林农业，2010(11):47－48.

［3］宋建英．邓恩桉的组织培养和植株再生［J］．林业科学，2010，46(6):138－145.

［4］朱鹏，徐建民．桉树扦插繁殖生根内在因素影响研究综述［J］．广西林业科学，2007，36(2):71－74.

［5］王蒂．植物组织培养［M］．北京:中国农业出版社，2004:164－168.

［6］陈家 龙，刘 辉，余 宏 傲，等．圆 叶 桉(Eucalyptus pulverulenta Sims)繁殖技术初探［J］．浙江农业科学，2009(3):692－694.