加巴喷丁对大鼠内脏炎症痛的镇痛作用及机制初步研究

张继国，张颜波，杨明峰，高允生

(泰山医学院1.药理学教研室、2.附属医院神经内科，山东泰安 271000)

内脏炎症痛作为病理性痛中炎症痛的一种，不同于神经病理性痛，是一种复杂的病理生理现象，其机制与镇痛研究是目前研究的难点、热点之一［1－8］。加巴喷丁作为一种新型抗癫痫药，已广泛应用于神经病理性痛治疗中，在内脏炎症痛中的作用尚不明确［9－11］。我们既往研究表明，蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)在内脏炎症痛起重要作用，PKC激活即膜转位参与内脏炎症痛的形成［1，5－7，12］。故本实验利用甲醛直肠黏膜下注射内脏炎症痛大鼠模型［1，5－7］，通过行为学、电生理学、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)等技术和方法，观察加巴喷丁对内脏炎症痛大鼠的镇痛作用，及其对PKC膜转位的影响，探讨相关镇痛机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 加巴喷丁(gabapentin，Sigma公司，美国)，PKC羊单克隆抗体(一抗，Santa Cruze公司，美国)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(二抗，Bio-Rad公司，美国)，ECL反应底物(Bio-Rad公司，美国)，BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE公司，美国)，Gel Doc凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)，钨丝电极(3～5 MΩ)、MD-103型微电极推进器、ME2-8201型微电极放大器、VC-11型记忆示波器(日本光电工业株式会社，日本)，Power Lab数据记录系统(AD Instrument Pty Ltd，澳大利亚)。

1.2 动物及分组 实验选用成年健康Wistar大鼠，体质量200～250 g，♀♂不拘(由山东大学动物中心提供(鲁动质字:200001001))。随机分为对照组:无任何处理，共18只;模型组:甲醛直肠黏膜下注射，共30只;生理盐水组:甲醛直肠黏膜下注射和腹腔内注射生理盐水(100 mg·kg－1)，共30只;加巴喷丁组:甲醛直肠黏膜下注射和腹腔内注射加巴喷丁(100 mg·kg－1)，共30只;生理盐水组、加巴喷丁组均在腹腔注射给药后40 min造模。

1.3 内脏炎症痛模型制备及行为观察 成年Wistar大鼠，应用100 μl 5%的甲醛，按照我室既往成熟造模方法，复制内脏炎症痛模型。行为学观察在麻醉清醒后，记录大鼠各种行为反应的次数，每15 min为一个时间段，共记录 2 h，8 个时间段［1，5］。采用一系列能够反应内脏痛强度的行为指标，①腹部舔食和轻咬(L);② 伸展身体，特别是后肢向后伸展(B);③腹部收缩、侧扭，有时身体发展成伸展姿势(C);④全身收缩，后背扭曲站立，并通常伴腹部痉挛(W)。根据疼痛程度依次评分为:L为1分;B为2分;C为3分;W为4分，每15 min进行一次疼痛计分(S)，共记录2 h，8个时间段。S=1L+2B+3C+4W，其中L、B、C、W分别代表15 min内记录到的各种行为反应的次数［1，5］。

1.4 脊髓背角神经元放电频率观察 用钨丝电极(3～5 MΩ)，在L6～S1背角处进行胞外记录。在找到对直肠刺激敏感的神经元后，记录放电15 min，作为前对照反应。然后观察记录注射甲醛后120 min内脊髓背角神经元放电频率的变化，每15 min作为一个时间段，共8个时间段。计算每15 min的平均反应频率，为满足不同组之间的可比性，排除细胞变异性的干扰，数据均作标准化处理。以给药前神经元的放电频率为参照，计算给药后反应的相对值:给药后实际反应频率/给药前实际反应频率 ×100%［12］。

1.5 脊髓标本的制备 各组于蛛网膜下腔给药后30、60、120 min时处死大鼠取脊髓。取出L6～S1节段脊髓按10 ml·g－1分别加入样品匀浆液A(mmol·L－1:Tris-Cl 50，EDTA 2，EGTA 2，DTT 2，sodium pyrophosphate 5，KF 50，Okadaic acid 5 ×10－5，5 mg·L－1each of leupeptin，aprotinin，pepstatin A，and chymostatin，pH 7.5)后，进行匀浆、超声破碎，然后于4℃，30 000×g离心30 min，取上清液作为胞溶蛋白成分。在剩余沉淀中加入匀浆液B(匀浆液A+0.5%NP-40)后，再次匀浆、超声破碎，4℃，30 000×g离心30 min，取上清液作为膜相关蛋白成分。采用BCA 法进行蛋白定量［6－7］。

1.6 PKC膜转位的测定 采用Western blot法测定细胞膜PKC的表达即膜转位水平。取7.5 μg的总蛋白，用10%的SDS-PAGE在4℃、20 mA条件下电泳。电泳完成后，在4℃、电流400 mA、3 h的条件下，将蛋白质从SDS-PAGE上转移至硝酸纤维素(NC)膜上，然后进行PKC Western blot实验。然后ECL试剂反应约5min后，在暗室中进行X-线胶片的曝光、显影和定影。PKC膜转位水平以其在胞膜中的含量占总蛋白(胞膜蛋白+胞质蛋白)含量的比值来表示［6－7］。

2 结果

2.1 内脏炎症痛大鼠的疼痛表现与加巴喷丁镇痛观察 甲醛直肠黏膜下注射致炎后，在乙醚麻醉恢复后大鼠立即会出现内脏疼痛的行为反应，前60 min内行为表现主要以W、C、B反应为主;而在后60 min内主要以L反应为主。模型组、生理盐水组和加巴喷丁组大鼠在注射甲醛后30 min均达到疼痛评分的最大值，从注射甲醛后45 min至120 min内，疼痛评分逐渐降低。加巴喷丁组在前90 min内疼痛分数低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，模型组与生理盐水组相比差异无显著性(P＞0.05)。

Fig 1 Comparison of pain scores at different time points following formalin injection(n=6)

2.2 甲醛直肠黏膜下致痛后神经元放电频率的变化 注射甲醛后，模型组神经元放电频率均立即明显增加，致炎后0～15 min和15～30 min的放电频率分别为致炎前基线水平的(258.0±38.4)%和(285.7±45.0)%，与致炎前相比均有明显增加(P＜0.01)。其余各时间段与致炎前相比虽有增加，但差异无显著性。见Fig 2。

Fig 2 Neuronal activity at different time points following formalin injection(n=6)

2.3 加巴喷丁对大鼠背角神经元放电频率的影响经腹腔给予加巴喷丁40 min处理后，甲醛直肠黏膜下注射致炎后神经元放电仍有增加，加巴喷丁组在致炎后0～15 min和15～30 min两时间段的脊髓背角神经元放电频率与模型组致炎后0～15 min与15～30 min的放电频率相比明显降低(P＜0.01);模型组和生理盐水组相比差异无显著性(P＞0.05)。见Fig 3。

Fig 3 Comparison of discharge frequency at different time points following formalin injection(n=6)

2.4 加巴喷丁对PKC膜转位的影响 甲醛致炎后30 min时PKC膜转位明显增高，以后时间段内逐渐降低至正常。在前60 min内，模型组、生理盐水组与对照组相比，PKC膜转位明显增加(P＜0.01)，模型组与生理盐水组相比差异无显著性(P＞0.05)，加巴喷丁组与模型组相比，PKC膜转位水平明显降低(P＜0.01或P＜0.05)。见Fig 4，5。

Fig 4 Membrane translocation of PKC at different time points following formalin injection(n=6)

Fig 5 Comparison of level of membrane translocation of PKC at different time points following formalin injection(n=6)

3 讨论

病理性痛是临床上常见的疼痛，主要由组织和神经损伤引起，通常分为炎性痛和神经病理性痛［8］。炎症痛分类中的内脏炎症痛的机制与治疗研究尚不完善，寻找安全有效治疗药物是亟待解决的难题之一。加巴喷丁作为一种新型治疗神经病理性痛的药物［10－11］，在内脏炎症痛中的镇痛作用缺少详细研究，故本实验选择加巴喷丁作为干预或治疗药物，具有重要意义。

我们以往的工作表明:①直肠黏膜下注射甲醛可以复制内脏炎症痛模型，甲醛直肠黏膜下注射后激活了包括 PKC 在内的痛觉敏感化通路［1，5－7］;②PKC及PKC亚型中PKCε、PKCγ在内脏炎症痛产生中起着重要作用［6－7］。所以本实验观察加巴喷丁对内脏炎症痛的镇痛效果外，进一步探讨其对PKC膜转位的影响，探讨其镇痛作用机制，具有完善工作基础和可行性。

本实验研究发现，加巴喷丁能明显减轻内脏炎症痛大鼠疼痛反应，减少脊髓背角神经元放电频率，表明其对内脏炎症痛起到明显镇痛作用，为以后临床应用提高实验依据。加巴喷丁在内脏炎症痛中的作用机制尚不明确，冯艺等［13］利用醋酸腹腔内注射大鼠内脏痛模型，研究发现加巴喷丁预治疗可明显抑制醋酸引起的大鼠脑脊液中谷氨酸、天门冬氨酸和丝氨酸浓度增高，抑制中枢兴奋性氨基酸的释放。PKC作为重要的内脏炎症痛信号传导分子，受兴奋性氨基酸信号系统的调控，是其下游重要的信号系统［14－15］。本实验研究发现，内脏炎症痛后，PKC 膜转位增加，PKC激活，参与内脏炎症痛产生;加巴喷丁能明显抑制PKC的膜转位，进而抑制PKC激活，阻断内脏炎症痛信号转导机制达到镇痛作用。

综上本实验不仅是加巴喷丁药理作用机制的完善，同时奠定加巴喷丁治疗内脏炎症痛研究基础。但PKC在内脏炎症痛觉中的传导通路是一条复杂的信号系统，其上游激活因子及其下游的作用底物还有待于明确;PKC超家族至少包括3组13种亚型，已经证实PKCε、PKCγ在内脏炎症痛产生中起着重要作用［5－7］，加巴喷丁对哪种亚型膜转位产生抑制作用尚不明确，所以本实验仅仅作为初步研究，加巴喷丁对PKC信号通路的影响更需要深入研究。

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