白芷根中香豆素类成分的组织化学定位研究

兰志琼 ，卢先明 ，陈继兰，周 毅，马逾英，胡友福

1.成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137；2.成都中医药大学基础医学院，四川 成都 611137

组织化学（histochemistry）是建立在形态学基础之上的边缘科学范畴，是研究细胞和组织中的化学组成、定位与定量以及代谢状态的科学[1]。组织化学的不断发展，为我们开展中药活性成分的产生、分布和积累规律提供了新颖、科学、可靠的方法。

白芷始载于《神农本草经》，为常用的解表、止痛药。现代研究结果表明，香豆素类化合物为白芷的主要有效成分之一。本文利用香豆素类成分的自发荧光性质，首次引入植物冰冻切片、荧光显微技术等组织化学研究方法，确定香豆素类成分在白芷根中的积累部位，为进一步揭示白芷活性成分香豆素类及其积累规律与白芷组织结构及发育的关系奠定一定基础。

1 仪器与试药

冰冻切片机（CM-1900，Leica），电控型倒置荧光显微镜（DMIRE2，Leica），显微摄影系统（DFC300，Laica）。

OCT包埋剂 （北京海德创业生物科技有限公司，批号：4583，118 ml/瓶），欧前胡素（宝鸡辰光生物有限公司，批号：482-44-0。准确称取欧前胡素0.1 mg，用甲醇溶解在10 ml量瓶中，定容即得欧前胡素溶液），无水乙醇、95%乙醇、甲醇、冰醋酸、福尔马林、丙三醇均为分析纯。

白芷根新鲜材料取自成都中医药大学（温江校区）药用植物园的栽培植物，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为伞形科植物杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan。 2011年 5月分3次取两年生白芷根中部新鲜材料做正式实验。

2 方法与结果

2.1 白芷根冰冻切片的制作

冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定硬度进行切片的一种方法[2]。该切片能更好地保存细胞内生物分子的活性，在组织化学、细胞免疫化学和原位杂交等研究中显示出独特作用。在动物和人体的研究中已被广泛应用，但在植物上的应用相对较少，在中药上的应用更是鲜见。因为与动物细胞相比，植物细胞有细胞壁和大液泡，含水量远大于相同体积的动物细胞，冷冻后的植物样品比动物样品硬度大，难以切片和保持植物组织结构的完整性。而且，对于一棵完整的植物，不同部位的质地及含水量存在巨大差异，如何改进冰冻切片技术，使之适用于不同质地的材料，是冰冻切片技术在植物学研究应用中所面临的一个重要问题。

首次开展白芷根横切面的冰冻切片制作技术的系统研究，经过大量预实验，发现影响白芷根冰冻切片质量的主要因素包括保护剂、包埋剂、切片厚度。故采用单因素实验方法综合分析，筛选白芷根冰冻切片的最佳制作技术。具体实验内容见表 1～3。

表1 不同保护剂对白芷根冰冻切片质量的影响

表2 不同包埋剂对白芷根冰冻切片质量的影响

表3 不同切片厚度对白芷根冰冻切片质量的影响

2.2 白芷根中香豆素类成分的自发荧光实验[3-4]

香豆素是邻羟基桂皮酸的内酯，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚；在紫外线照射下易产生蓝色荧光，且新鲜材料的荧光性很少变化[5]。

2.2.1 白芷根的荧光显微镜观察 将切好的白芷根材料置于载玻片上，稀甘油制片，置荧光显微镜下，用紫外光进行激发，观察并照相。

2.2.2 同步阳性对照 取欧前胡素标准品试液于载玻片上，稀甘油制片，置荧光显微镜下，用紫外光进行激发，观察并照相。

2.2.3 同步阴性对照 将切好的白芷根材料置于载玻片上，滴加70%乙醇配制的FAA固定液，固定大约30 min，依次经过85%、95%、100%乙醇处理后，用稀甘油制成临时制片后，置荧光显微镜下，用紫外光进行激发，观察并照相。

2.3 实验结果

2.3.1 白芷根冰冻切片的制作 通过单因素考察实验，即在不同条件下进行切片，然后在光学显微镜下对各组切片进行观察、比较并照相，结果显示，以15%的甘油作为保护剂，OCT为包埋剂，切片厚度为30 μm的白芷根冰冻切片效果最佳。根据以上结果，结合植物冰冻切片基本操作步骤，得到白芷根冰冻切片的制作技术：取白芷根中部新鲜材料，切成约0.5 cm的小段，立即投入装有15%甘油保护剂的安瓿瓶中，将其置于玻璃真空干燥器中，使用旋片式真空泵抽气20 min，使材料空腔完全被保护剂所填充。然后取出，用冰冻切片机进行切片，切片厚度为20～30 μm，用稀甘油制成临时制片后，立即在荧光显微镜下观察。

2.3.2 白芷根的荧光显微镜观察 白芷根横切面从外到内结构依次是：木栓层、栓内层、韧皮部、形成层、木质部。在紫外线的激发下，根的木栓层、木质部及栓内层、韧皮部中的分泌组织处均有强烈的蓝色荧光出现（图1～2）。

图1 白芷根横切面（荧光显微镜下，示木栓层、韧皮部）

图2 白芷根横切面（荧光显微镜下，示韧皮部、木质部）

2.3.3 同步阳性对照 在紫外线的激发下，欧前胡素有强烈的蓝色荧光出现（图3）。

图3 欧前胡素（荧光显微镜下）

图4 白芷根横切面（荧光显微镜下，经乙醇处理过）

2.3.4 同步阴性对照 经过乙醇处理后的白芷根冰冻切片，在紫外线的激发下，其木栓层和木质部仍有荧光产生，而分泌组织处的荧光消失（图4）。

3 讨论

本实验为首次系统开展白芷根冰冻切片制作技术研究，筛选出白芷根冰冻切片的最佳制作技术；首次引入组织化学研究方法，通过科学实验证实在白芷根中，香豆素类成分仅分布在分泌组织中。该研究为进一步揭示白芷活性成分香豆素类及其积累规律与白芷内部结构及发育的关系奠定一定基础。

本研究仅对白芷根中活性成分之一香豆素类成分进行了组织化学定位研究，有待引入现代先进技术如激光共聚焦显微镜技术开展相对定量研究，并可开展白芷药材另一活性成分挥发油的组织化学研究，以期为进一步研究中药白芷活性成分及其积累规律与其内部结构及发育的关系奠定扎实的基础。

[1]郑艳,徐珞珊,王峥涛.组织化学在药用植物研究中的应用[J].现代中药研究与实践,2007,22(3):61-63.

[2]谢佩松,徐中根,韦存虚.冰冻切片技术在植物显微结构和组织化学中的应用[J].生物学杂志,2009,6(3):72.

[3]辛华,丁雨龙.珊瑚菜中香豆素的组织化学定位[J].广西植物,2008,28(6):847-850.

[4]秦玲,刘文哲.补骨脂中呋喃香豆素类物质的积累规律及组织定位[J].武汉植物学研究,2007,25(4):360-365.

[5]He JL,Yang KR,Li XG.The Principle of Apparatus Analysis[M].Beijing:Science Press,2002:17-42.