RNAi抑制促血管形成因子治疗结肠癌的研究

齐 霁 ，邹小龙

1.北京市中西医结合医院消化内科，北京 100029；2.哈尔滨医科大学附属第一临床医院普外科，黑龙江 哈尔滨 150081

肿瘤的发生和发展是多因素、多基因相互作用的结果。传统基因治疗技术一般是在基因水平特异性地诱导单个癌基因失活，即基因治疗只通过对某一个癌基因进行抑制从而起到治疗作用，但是对于多基因致病的肿瘤来说，仅对其中某个基因实现基因沉默很难达到预期的疗效。与此同时，基因治疗是指在转录水平诱导基因发生沉默，这种治疗的生物安全性较差。而技术日趋成熟的RNA干扰（RNAi）技术的不断发展和完善为解决传统基因治疗的生物安全性问题提供了一种可能。RNAi是一种基因转录后沉默技术，这种技术不仅可以产生类似于基因敲除的效果，又不会对目标DNA序列产生任何遗传上的改变。由于RNA干扰序列具有很强的序列特异性，因此在RNA干扰序列设计的过程中可以利用同一基因家族中的多个基因具有同源性很高的一段保守序列这一特性，设计出针对某些序列的特异siRNA分子。而后通过注射设计好的siRNA使同源基因产生基因沉默效应，同时，与传统的基因治疗相比，这种RNAi对机体其他的基因产生不良影响较少[1]。RNAi技术具有较高的稳定性和基因沉默的效率，而且将siRNA进一步地加以修饰就可以有效地避免核酸酶的降解，使其更稳定地发挥作用，从而实现对90%以上的基因进行沉默。综上所述，RNAi技术在肿瘤的病因研究和靶向治疗等方面具有明显的优势。因此，充分发挥RNAi技术的优势对于肿瘤研究和治疗有着举足轻重的作用。本课题组之前的研究发现，Del1和VEGF分属于不同类别的促血管形成因子，这两类因子在结肠癌的肿瘤血管生成方面具有协同的促进作用[2]。本实验使用RNAi抑制促血管形成因子基因的表达，观察结肠癌的基因治疗效果，从而明确RNAi抑制促血管形成因子的基因治疗方式对结肠癌治疗效果的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

5周龄BALB/C裸鼠（nu/nu）60只，购于上海伊莱克斯实验动物有限责任公司。Del1和VEGF基因shRNA表达质粒和阴性对照质粒由武汉晶赛公司构建合成。

1.2 ShRNA表达质粒的构建

Del1和VEGF基因shRNA表达质粒和阴性对照质粒由武汉晶赛公司构建合成。四条针对Del1基因（Genbank HSU7_0312）不同靶点的shRNA筛选设计后构建于同一个质粒中，四条shRNA的序列为：AATGGAGGTATCTGTTTGC CA（207～227nt）；GTTCAGTGTTGTGGAGGT（286～304nt）;AAGC ATACCGG-GGGATACAT （388～408 nt)；AATGTCATCGACCTCCCATC（1443～1463 nt）。 合成的重组质粒记为pshRNADel1。三条针对VEGF基因（GenBankNM_001033756）不同靶点的shRNA筛选设计后构建于同一个质粒中，三条shRNA的 序 列 为 AGAAAGATAGAGCAAGACA （1429～1447 nt）；CGCAGAAGTGCTAGCTCG（728～746 nt）；CCTTGCCTGCTGCT CTAC （1064～1082 nt）。合成的重组质粒记为 pshRNAVEGF。经过BLASTN检验与其他基因没有同源性。晶赛公司将4种不同哺乳动物的启动子 （hU6、hH1、mU6和h7SK）分别操纵的shRNA转录结构单元，即启动子－shRNA正义链－loop环－shRNA反义链－终止信号构建到一个RNAi载体中，从而实现了一个载体编码4条shRNA的目的。不同的启动子转录其相应的shRNA结构单元，其结果不仅可以有效地避免意外重组的发生，而且可以使每条shRNA都能够有效地完成转录。

1.3 肿瘤细胞悬液的制备

待肿瘤细胞培养至60%～70%融合时，弃去肿瘤细胞培养液，PBS冲洗2遍后，培养瓶中加入胰酶消化90 s，其后加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，实现终止消化并用吸管将贴于瓶壁的细胞吹打下来，而后将混合物一起放置于50 ml的离心管中，将离心机转速调至1000 r/min，离心5 min后，弃上清液，加入20 ml PBS重悬均匀后进行细胞计数，同时调整细胞浓度为5×107个/ml，最后吸入1 ml注射器中备用。

1.4 裸鼠的肿瘤接种

将适应SPF环境的5周龄裸鼠建立结肠癌动物模型。首先在将裸鼠的笼子进行消毒处理。固定裸鼠，取其侧腹部为穿刺点，穿刺前用碘伏对穿刺点进行消毒，注射器针头皮下潜行1 cm左右深进行穿刺，缓慢向该部位推注肿瘤细胞悬液0.1 ml/只。推注完成退针后，再次进行消毒。

1.5 裸鼠的分组

接种后观察裸鼠成瘤情况。并在成瘤后用游标卡尺测量肿瘤体积：肿瘤体积 V=π/6×a2×b，π=3.14[注：长径（b）、短径（a）]。待裸鼠接种肿瘤生长至体积约为100 mm3时，将60只接种肿瘤的裸鼠随机分为5组，分别为未转染质粒组（Untreated组）、转染空质粒对照组（Control组）、转染 pshRNADel1质粒组（pshRNA-Del1治疗组），转染pshRNA-VEGF质粒组 （pshRNA-VEGF治疗组）和转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组 （pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF治疗组）。进行基因治疗4 d，5组成瘤裸鼠各组随机抽4只，检验其肿瘤中的基因表达情况。其余的裸鼠治疗3周后，将裸鼠处死并进行后续的研究。

1.6 肿瘤的治疗及观察指标

1.6.1 肿瘤治疗 基因转染液的配制：将浓度为2 mg/ml的纯化真核表达质粒 100 μl，用 100 μl FuGENE6稀释待用。将目的基因 重组 质 粒 pshRNA-Del1，pshRNA-VEGF，pshRNADel1+pshRNA-VEGF在FuGENETM6的介导下转染至细胞中，其使用的剂量为每只裸鼠每次200 μg质粒与100 μl FuGENETM6混合，直接对裸鼠瘤体内多点行混合注射。Control组裸鼠处理方式是在肿瘤内注射200 μg的pshRNAGFP质粒；pshRNA-Del1治疗组裸鼠的处理方式是在肿瘤内注射200 μg的pshRNA-Del1质粒；pshRNA-VEGF治疗组裸鼠的处理方式是在肿瘤内注射200 μg的pshRNA-VEGF质粒；pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF治疗组裸鼠的处理方式是在肿瘤内先注射100 μg的pshRNA-Del1质粒，间隔12 h以后，再在肿瘤内注射100 μg的pshRNA-VEGF质粒。

1.6.2 观察指标 ①肿瘤生长曲线：在肿瘤内注射药物后，每天观察肿瘤的生长情况，并且于注射药物后的第0、3、6、9、12、15、18、21天分别用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径的大小并记录，而后计算肿瘤的体积大小。测量后将各组裸鼠肿瘤的体积取平均值，绘制皮下肿瘤的生长曲线图。②蛋白质印迹（Western-blot）：在进行了质粒注射4 d后，切取肿瘤标本，进行低温保存。部分肿瘤组织采用蛋白印迹的方法对各组Del1蛋白和VEGF蛋白的表达情况进行测定，测定中将分组中的未转染质粒对照组（untreated组）视为蛋白定量检测的对照组。③免疫组织化学检测分析：采用免疫组织化学两步法，组织切片常规脱蜡，3%过氧化氢孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。根据所应用的一抗的要求，对组织切片进行预处理（抗原修复）。滴加小鼠来源的一抗（Ki-67，CD31、VEGF 和 Del1抗体），室温孵育 60 min，PBS或 TBS冲洗，2 min×3次。滴加兔抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育20 min，PBS或TBS冲洗，2 min×3次。应用DAB溶液染色。蒸馏水冲洗10 min、苏木精复染、脱水、中性树脂封片。

1.7 统计学方法

采用SPSS 11.5统计分析软件进行数据处理。免疫组织化学的统计分析采用χ2检验。其他实验数据以均数±标准差（）表示，采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤生长曲线

在肿瘤模型建立后，当肿瘤的体积达到100 mm3时，随机将其分为以下5组：未转染质粒组（Untreated组），转染空质粒对照组（Control组）、转染pshRNA-Del1质粒组（pshRNADel1治疗组），转染pshRNA-VEGF质粒组（pshRNA-VEGF治疗组）和转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组（pshRNADel1+pshRNA-VEGF治疗组）。如图1所示：在相同时间点，未转染质粒组和转染空质粒对照组比较，肿瘤的体积未见明显差异（P＞0.05）；而转染pshRNA-Del1质粒组和转染pshRNA-VEGF质粒组分别于与对照组相比较发现，其肿瘤的平均体积明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步的分析显示，转染pshRNA-Del1质粒组的肿瘤平均体积与转染pshRNA-VEGF质粒组的肿瘤平均体积间无明显的差异（P＞0.05）。与其他各组相比，笔者发现转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组的肿瘤平均体积最小，该治疗组与对照组的肿瘤体积比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组分别与转染pshRNA-Del1质粒组、转染pshRNA-VEGF质粒组以及转染空质粒对照组肿瘤体积比较，差异均有统计学意义 （均P＜0.05）。

图1 肿瘤生长曲线图

图2 West-blot检测蛋白表达变化图

2.2 肿瘤基因治疗后各治疗组Del1蛋白和VEGF蛋白的表达

对肿瘤行基因治疗4 d后，从各治疗组均随机选取4只裸鼠处死，并切除其肿瘤组织待后续研究。选取转染空质粒组作为后续分析的对照组。取切除肿瘤部分组织制备组织匀浆，并提取其蛋白，利用West-blot方法检测Dell基因和VEGF基因的蛋白表达量，从而进一步分析基因治疗前后，各组内这2种蛋白的表达变化。如图2和图3所示：与对照组相比，Del1蛋白的表达量在转染pshRNA-Del1质粒组和转染pshRNA-VEGF质粒组明显呈下降的状态，并且Del1蛋白的表达量在组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与此同时，笔者发现转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组Del1蛋白的表达量下降最为明显，与对照组相比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。但转染pshRNA-Del1质粒组和转染pshRNA-VEGF质粒组相比较，Del1蛋白的表达量未见明显的差异 （P＞0.05），但这两组分别与转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组比较，差异均有统计学意义 （均P＜0.05）。对于VEDF蛋白的表达来说，转染pshRNA-VEGF质粒组与对照组中VEGF蛋白的表达量比较，其明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），同时笔者发现Del1蛋白的表达量也呈现明显下降的状态。转染pshRNA-Del1+pshRNAVEGF质粒组和对照组相比，其VEGF蛋白的表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。但是转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒治疗组与转染pshRNA-VEGF质粒治疗相比，VEGF蛋白的表达量无变化（P＞0.05）；转染 pshRNADel1质粒组与对照组相比，VEGF蛋白的表达量无变化 （P＞0.05），但Del1蛋白的表达量明显地下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 蛋白表达变化图

2.3 肿瘤细胞的Ki-67免疫组化染色结果

对于肿瘤组织进行RNAi治疗4 d后，每组随机选取4只裸鼠处死。将每个切取的肿瘤组织先用多聚甲醛固定，而后用石蜡包埋，然后进行连续切片，切片厚度4 μm。完成上述处理后，用抗Ki-67的抗体进行免疫组化染色，标记肿瘤组织中增殖的肿瘤细胞。将转染空质粒组作为对照组，定性的染色结果如图4所示：细胞核染为棕色的为Ki-67染色阳性肿瘤细胞。笔者发现与对照组相比，转染pshRNA-Del1质粒组、转染pshRNA-VEGF质粒组和转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组的肿瘤细胞呈现减少的趋势。从定量的角度研究肿瘤细胞增殖的变化是否显著，其结果如图5所示。从图5的结果可以发现：与对照组相比，转染pshRNA-Dell质粒组和转染pshRNA-VEGF质粒组中的肿瘤细胞增殖百分比明显降低，并且与对照组相比，其肿瘤增殖率差异有统计学意义 （P＜0.05）。从图5中笔者发现转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒组肿瘤细胞的增殖是最低的，并且这组与对照组相比较，其差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

图4 染色肿瘤细胞增殖变化图

图5 肿瘤增殖率变化图

2.4 肿瘤的微血管密度

对肿瘤组织进行RNAi治疗3周后，将各组的裸鼠处死，测量其肿瘤的各个径线后，用4%的多聚甲醛固定，而后用石蜡包埋并连续切片，切片厚4 μm。采用抗-CD31单克隆抗体行二步法免疫组化染色检验肿瘤的微血管密度变化，其中棕色染色为阳性，在肿瘤组织切片中，随机地选取不同的位置来记录微血管的密度变化。将转染空质粒组作为对照组，如图6所示：与对照组相比，转染pshRNA-Del1质粒组、转染pshRNA-VEGF质粒组和转染pshRNA-Del1+pshRNAVEGF质粒组的肿瘤微血管密度呈现减少的趋势。从定量的角度而言，如图7显示，与对照组相比，转染pshRNA-VEGF质粒组中其肿瘤的微血管密度减少量约为40%，该组与对照组肿瘤的微血管密度比较，差异有高度统计学意义 （P＜0.01）。转染pshRNA-Del1质粒组的肿瘤微血管密度也较对照组减少了24%，这两组肿瘤的微血管密度比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。此外，与对照组相比，转染pshRNADel1+pshRNA-VEGF质粒组较对照组的肿瘤微血管密度减少了60%，并且这两组间肿瘤微血管密度比较，差异有高度统计学意义 （P＜0.01）。与此同时，笔者发现转染pshRNADel1+pshRNA-VEGF质粒组的肿瘤微血管密度分别与转染pshRNA-Del1质粒组和转染pshRNA-Del1质粒组相比，均呈现下降的状态，并且肿瘤微血管密度在组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。转染 pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF 质粒组肿瘤的微血管密度减少最明显，也说明了pshRNA-Del1质粒和pshRNA-VEGF质粒在抑制肿瘤微血管生成方面具有较强的协同作用。

图6 肿瘤新生血管切片染色图

图7 肿瘤新生血管的密度变化图

3 讨论

恶性肿瘤的发生是多个癌基因共同作用的结果，是多因子、多水平的异常引起的恶性疾病。现阶段对于癌症的临床治疗治疗，控制血管再生过程是控制恶性肿瘤发生发展的重要手段。血管再生是有多种细胞分泌的多种细胞因子参与的、在预存的血管上产生新的毛细胞血管的过程[3]。众所周知，肿瘤细胞的促血管生成过程与很多细胞因子有关，如生长因子，肿瘤坏死因子-α、趋化因子、P53和成纤维生长因子2等，但在本研究中，笔者选择了在肿瘤组织和正常组织呈现显著差异表达的促血管再生因子VEGF和内皮细胞生长调节蛋白Del1[4-5]。肿瘤中酸性、低氧的肿瘤微环境，可以诱导VEGF的大量表达[6]。VEGF可以通过旁分泌促进局部微血管的新生，从而为肿瘤细胞提供了营养补给，促进了肿瘤细胞的生长，起到了促血管生成的作用。与此同时，VEGF也可以通过自分泌起到血管透性因子的作用，从而影响肿瘤细胞侵袭、转移和凋亡的细胞行为，以及干扰宿主抗原提成和加工等免疫过程，从而促进了肿瘤的发生和发展[7]。此外，在肿瘤细胞中，VEGF蛋白与KDR基因发生互作以后，共同激活MAPK级联通路，从而增加了HSP90蛋白的表达从而诱导了BCL2基因的过表达，最终抑制了细胞的凋亡过程[8]。因此，可以通过用RNAi技术来实现对VEGF基因的沉默，从而使得细胞的凋亡过程不受抑制，从而可以实现对结肠癌肿瘤细胞增殖的抑制。对于DEL1基因的作用，Chiaki Hidai等[9]首次在1997年的小鼠胚胎研究中进行了报道报道，DEL1基因在受精后9 d的胚胎中表达量呈现上调，而后微血管的密度逐渐加大，随着血管网络的日趋成熟，DEL1的表达量又开始逐渐下降，直到出生后Del1的表达量不呈现差异表达。这也就说明与血管生成调节因子（flk1）和血小板内皮细胞黏附因子（CD31）的作用类似，DEL1在胚胎发育的不同阶段呈现特定的表达模式[10]。这些内皮细胞的变化的标志物，提示Del1对于血管细胞的生成和内皮细胞的变化具有很重要的调节作用。本研究利用转染pshRNA-Del1质粒、转染pshRNAVEGF质粒和同时转染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF质粒对裸鼠的移植肿瘤进行RNAi治疗，结果显示无论是抑制Del1还是抑制VEGF蛋白的翻译都可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖。但是对比这两组之间的肿瘤生长情况，未见差异。该结果显示Del1和VEGF都可以作为抑制结肠癌肿瘤细胞生长的药物靶点。进一步来说，本研究中也发现协同的抑制Del1和VEGF两个蛋白对于肿瘤细胞的生长和增殖，以及肿瘤细胞的微血管密度都有更好的抑制作用，因此，在今后的研究中可以考虑同时抑制Del1和VEGF两个蛋白，以期望取得更好的治疗效果。

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