小干扰垂体特异性转录因子-1对大鼠垂体生长激素肿瘤细胞侵袭行为的影响

范月超，张 慧，李锦晓，李中林，纵振坤，陈 晨，冯 力，苗发安，谢满意

徐州医学院附属医院神经外二科，江苏 徐州 221002

垂体生长激素腺瘤是内分泌症状活跃的一种侵袭性垂体瘤，生长激素（CH）过度分泌，被视为恶性的内分泌肿瘤，它可以造成全身各系统的损害并危及生命，虽然手术可以明显改善患者的临床症状，但术后患者的内分泌生化指标不令人满意，复发率高，因而无法达到生物学治愈。研究表明[1-2]，垂体特异性转录因子-1（pituitary-specific transcription factor-1，pit-1）是重要的组织特异性转录因子，对生长激素基因表达有着重要的调控作用，不仅可以激活GH基因的表达，而且能够调控细胞生存和增生所必须的其他相关基因。Pit-1基因在垂体腺瘤的发生及侵袭行为中扮演什么样的角色，目前尚无相关研究。本实验通过设计pit-1 siRNA转染大鼠GH3型垂体瘤细胞，探讨pit-1对垂体腺瘤生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠垂体瘤细胞购于美国ATCC细胞库，F-12k营养富集培养基（美国Gibco公司），马血清（美国Gibco公司），胎牛血清 （杭州四季青 ），siRNA oligo （Gene Pharma），lipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），RT-PCR （大连宝生物）。P44/42MAPK 一抗（碧云天），Boyden小室（Millipore公司），纤维连接蛋白、Matrigel胶（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将GH3细胞用含15%马血清+2.5%胎牛血清的F-12K培养基培养，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中常规培养、传代（2～3 次/周）。

1.2.2 RNA干扰 针对大鼠pit-1基因的三条siRNA oligo由上海吉玛制药技术有限公司合成并测序鉴定，序列如下：Pit1-rat-602：5′-GGCUCCGAAUUCAGUCAAATT-3′；Pit1-rat-138：5′-CCUCGGC-UGAUACCUUUAUTT-3′；Pit1-rat-262：5′-GCGACAGGACUUCAUUAUUTT-3′。将状态良好的细胞接种于6孔板，在24 h内使细胞汇合达到90%，然后应用lipofectamineTM2000，按照说明书步骤进行转染。转染后细胞放在CO2培养箱中37℃温浴24～48 h后，提取细胞总RNA检测pit-1干扰后的效果。

1.2.3 RT-PCR分析pit-1 mRNA的表达 由Genbank检索pit-1 mRNA序列，利用Primer3.0在线设计引物并经BLAST检验，pit-1 引物正义链：5′-ATTCAGTCAAACAACCATCTGC-3′，反义链 5′-aAAGTGTCTCTCCAAA-GCATCC-3′，产物长度 273 bp。 β-actin基因上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAA-3′， 下游引物：5′-AGCCACCAATCCACACAG-3′，扩增产物大小173 bp，均由invitrogen公司合成。

1.2.4 提取总RNA 利用oligo（dT）20引物和SuperScript RT试剂盒逆转录成cDNA，进行PCR扩增反应。反应条件：94℃3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环，72℃延伸10 min。PCR引物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙啶染色后，用自动电泳凝胶扫描分析系统采集并分析电泳目的条带的积分密度值（integrated density value,IDV），将 pit-1 IDV/βactinIDV做为其mRNA水平的相对值，每次实验至少重复3次。

1.2.5 Boyden小室分析pit-1 siRNA对肿瘤细胞侵袭力和趋化作用的影响 取对数生长期的细胞接种于6孔板内，每孔3×105/ml，贴壁后，转染，设空白对照组，阴性对照组及转染组。

1.2.6 Boyden小室的制备 细胞培养池的多孔PET膜直径为 6.5 mm， 孔径 8.0 μm，4℃条件下将1∶3稀释后基质凝胶（Matrigel Matrix，Becton Dickison Labware产品） 铺于小室细胞培养池的 PET 内表面，30 μl/孔，放入培养箱，37℃过夜。重悬细胞以不含血清的培养基调整细胞密度为1.5×106/ml，24孔板加入含15%马血清+2.5%胎牛血清的培养基500 μl。5%CO2，37℃培养箱培养 24 h。

1.2.7 细胞固定、染色和侵袭性的计算 取出Boyden小室用PBS洗2遍，然后将PET的下表面浸泡于70%甲醛中，室温固定30 min，风干，结晶紫染色10 min，用棉签擦去上表面细胞，显微镜高倍镜下计数PET膜下面的细胞数（图2），每个样本计数5个视野，取平均数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料采用t检验、校正的t检验，计数资料采用Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pit-1 siRNA干扰效果的检测

针对pit-1基因设计三条高特异性siRNA oligo，分别为si138、si262和si602，并通过RT-PCR检测三条小干扰在GH3垂体腺瘤细胞中对pit-1的敲除效果（图1）。结果显示：未转染和pit-1 siRNA转染GH3细胞均可检测到pit-1 mRNA的表达，但两者比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。在GH3垂体腺瘤细胞中三条小干扰的敲除效果均在70%～80%。表明三条siRNA片段均能有效抑制GH3细胞内pit-1的表达，实现其基因沉默效应。

2.2 pit-1 siRNA对肿瘤细胞侵袭力和趋化作用的影响

转染组、阴性对照组两组细胞的侵袭力影响：每组分别取4个视野取其均数，结果显示阴性对照组细胞通过Boyden小室PET膜的数量明显多于转染组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见图 2。

图1 pit-1 siRNA转染GH3细胞24 h后各组细胞pit-1 mRNA的表达水平

图2 利用Boyden小室测定pit-1 siRNA对GH3细胞侵袭力作用的影响

3 讨论

垂体特异性转录因子pit-1编码POU结构域 （PITOCT-UNC domain）中的pit-1蛋白，包含1个POU特异性区域（POU-specific domain，poU-SD）和 1个 POU 同源性区域（Pou-homoeodomain，POU-HD），pit-1 基因在人类位于第 3号染色体，全长43 kb，由6个外显子和5个内含子组成[3]。有研究发现[4-5]，pit-1有促进垂体细胞增殖的作用，对垂体肿瘤细胞生长起重要作用。许多垂体功能低下的疾病也被认为与pit-1的缺失有关[6]。而关于小干扰技术阻断pit-1的表达对垂体瘤细胞侵袭作用的影响，相关研究很少。

本实验设计针对pit-1的siRNA，应用脂质体（lipofectin2000）转染pit-1的siRNA进入GH3腺瘤细胞，通过RT-PCR检验pit-1基因的干扰效果，以探讨pit-1基因在GH3腺瘤中的作用。结果未转染和转染pit-1 siRNA的GH3细胞均可检测到pit-1mRNA表达，但两者比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。在GH3垂体腺瘤细胞中三条小干扰的敲除效果均在70%～80%。表明三条siRNA片段均能有效抑制GH3细胞内pit-1 mRNA的表达，实现其基因沉默效应。制备Boyden小室测定pit-1 siRNA对肿瘤细胞侵袭力和趋化作用的影响，结果表明阴性对照组细胞通过Boyden小室PET膜的数量明显多于转染组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结果证明：干扰pit-1基因对GH3腺瘤的侵袭性有重要的抑制作用。

以pit-1为靶点治疗垂体腺瘤，目前国内尚鲜见相关研究。通过本实验证明：pit-1基因在GH腺瘤的侵袭性方面起着重要作用。通过反义技术可以高效、专一地抑制pit-1的表达，为侵袭性垂体肿瘤的治疗提供了一条有益途径。

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