漯河地区食管癌患者癌组织中人乳头状瘤病毒感染的检测

崔明辰 岳鹤声 张冬云 赫 欣 王建国 宋晓兵

人乳头状瘤病毒(HPV)与女性生殖道某些肿瘤、尤其是宫颈癌的发生关系密切。近年来，有关HPV在食管癌中的研究有大量报道，但结果差别很大。本研究应用PCR法，使用HPV L1基因区通用引物、HPV16和18型E6基因特异性引物对115例河南省漯河地区食管癌标本中的HPV感染情况进行检测和分析，初步探讨其与漯河地区食管癌的相关性，以期为深入认识HPV与食管癌的关系及可能的防治策略提供线索。

材料与方法

1.材料:115例石蜡包埋的河南省漯河地区食管鳞状细胞癌术后病理标本，均为2005年1月～2009年3月漯河医学高等专科学校第二附属医院病理科存档标本，所有标本经10%甲醛溶液固定、石蜡包埋保存，连续5μm切片。

2.组织块中全核酸的提取:使用石蜡标本DNA提取试剂盒(凯普生物化学有限公司)，按说明书提示，提取组织全核酸后于－20℃保存。

3.HPV的PCR检测:使用β－actin作内参(PCR产物为290bp)，使用 HPV L1区 GP5+/6+引物、HPV16 E6和HPVl8 E6型特异性引物进行PCR扩增。按HPV GP5+/6［1］以及 HPVl6 E6 和 HPVl8 E6 型特异性引物［2］的扩增条件。PCR中使用了Ex－Taq酶(宝生物，大连)，每个反应总体积为50μl，加入1μl提取的组织全核酸作为模板。阳性对照使用的HPVl6及18全基因组质粒由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室病毒基因工程国家重点实验室刘宏图教授惠赠。本研究使用的引物序列及扩增产物的长度见表1。

结 果

1.标本全核酸的提取:标本 DNA提取后，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行观察，从图1可以明显看出代表人全核酸的条带:所提标本DNA约在500bp～20kb处有泳动条带不等，而人类基因组核酸DNA泳动条带约为20kb，人类新鲜组织所提DNA泳动条带约为20kb，出现这种现象的原因可能是标本经甲醛浸泡或石蜡包埋后使得标本中的DNA发生了断裂，出现了较小断裂DNA片段。

表1 扩增引物序列及扩增产物长度

图1 提取的组织DNA

2.标本全核酸的质量控制:使用β－actin的内参PCR反应对提取的115例标本全核酸进行质量控制，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列为TCACCCAC ACTG TG CCCATCT和GAACCGCTC ATT GCCAATGG。PCR反应总体积为50μl，反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，共进行35个循环。以293细胞提取全核酸为模板的阳性对照，其产物大小为290bp，提取的食管癌组织全核酸为模板的PCR产物大小与阳性对照相近，说明组织中所提全核酸可满足进一步实验要求(图2)。

3.标本HPV检测:GP5+/6+是国际上广泛使用的HPV L1基因区通用引物，可检测20多个型别HPV。对115例食管癌样品进行了PCR检测，用含有HPV16、18全基因组的质粒作为本组实验阳性对照，可观察到约150bp的GP5+/6+扩增产物。与之参照，115例食管癌样品中，检测到86例HPV阳性，HPV阳性率为74.8%。同时，我们分别使用HPV16和18两型别E6基因特异性引物对样品进行了PCR检测。有56份样品检出HPV16 E6基因，其阳性率为48.7%;20个样品可检测到HPV18 E6基因，其阳性率为17.4%;12个样品同时具有HPVl6和18两个型别E6基因的扩增子，可以认为这12份样品是HPV16和18两个型别的混合感染。HPV16和18总感染率为55.7%(表2)。

表2 河南省漯河地区食管癌组织中HPV DNA检测结果

讨 论

食管癌是世界上最常见的6大恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤，占我国恶性肿瘤相关死因的第4 位［3］。1982 年 Syrjanen［4］首次提出食管癌形态学改变与生殖道疣非常相似，认为人乳头状瘤病毒和食管癌的发生可能有关。HPV是一组体积较小的双链DNA病毒，目前已分离了120多种亚型，其中15种高危型HPV的感染已被证明是引起宫颈癌的必要因素［4］。

但是与宫颈癌组织中HPV感染情况不同的是，食管癌组织中HPV感染率在不同的国家、不同的地区及同一地区差异极大。刘宏图教授领衔的研究团队曾使用HPV6、11、16和18的通用引物，在广东潮汕地区检测过新鲜食管癌切除组织样品，发现HPV16和18的分布频率分别约为40%和20%，检出率随不同批次有所改变，两型别合计存在比率在60%～70%之间变动;应用HPV L1通用引物GP5+/6+、HPV16 E6和HPV18 E6型特异性引物，在河南省林州市食管癌样品中HPV16和18的检出率为71.0%［5］。本研究中，漯河地区石蜡包埋食管癌组织中HPV检出率为55.7%，低于上述两地食管癌标本中HPV16、18检出率，造成这些差异的原因可能与标本来源、病变取材部位、标本数量、环境地理因素、遗传易感性和检测方法不同有关。本研究确定了我国河南省漯河地区食管癌组织中有HPV存在，其中HPV16的感染占很大比例，并且HPV感染可能是食管癌发生的重要病因。这为下一步阐明食管癌多阶段演进的分子机制，建立高危人群检测和早期诊断生物指标和手段奠定了工作基础。

1 Karlsen F，Kalantari M，Jenkins A，et al.Use of multiple PCR seta for optimal detection of human papillomavirus［J］.J Clin Microbilo，1996，34(2):2095－2100

2 Sotlar K，Diemer D，Dethleffs A，et al.Detection and typing of human papillomavirus by E6 nested multiplex PCR［J］.J Clin Microbiol，2004，42(5):3176 －3184

3 Gao GF，Roth MJ，Wei WQ，et al.No association between HPV infection and the neoplastic progression of esophageal squamous cell carcinoma:Result from a cross－sectional study in a high－risk region of China［J］.Int J Cancer，2006，119(3):1354－1359

4 Zur HH.Cervical carcinoma and human papillomavirus on the road to preventing a major human cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93(6):252－253

5 李淑英，李颖，王立东，等.应用聚合酶链反应检测食管癌组织中人乳头状瘤病毒［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2008，22(3):251－253