甜菜抗氧化性的电喷雾串联质谱研究

张婷婷 ，许庆轩 ，孙 晖 ，周 芹 ，吴玉梅

（1.农业部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨150080；2黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040）

植物提取液抗氧化能力的测定方法很多，其原理总结起来主要为两种方式[1]，其一，通过测定样品抑制脂类物质氧化的能力来评定被测物的抗氧化能力；其二，用样品对人工生成的自由基的清除能力来反映待测物的抗氧化活性。植物中具有抗氧化活性的成分主要有黄酮类、多酚类、维生素类、皂苷类、生物碱类和糖类化合物[2]。由此可以看出，具有抗氧化活性的化合物一般需要含有还原性的官能团，使其能够和氧化剂发生氧化还原反应；其次要含有使自由基稳定的结构，也就是分子中含有共轭体系，有利于其与自由基结合，从而消除自由基。目前测定抗氧化能力的方法均从宏观角度检测植物总提取液的抗氧化性，如果要知道是哪种成分起作用，就需要通过大量提取分离工作，得到单一的化合物，再对这些纯化合物进行抗氧化性测定。由于植物成分十分复杂，提取分离工作十分艰巨，并且一些低含量的成分很可能在提取分离过程中损失，采用这种方法常常效果不佳。因此寻找一种快速、简便的方法对复杂体系的抗氧化性进行研究十分必要。

电喷雾质谱可以不经过复杂的前处理就可以对植物提取液直接分析。由于电喷雾电离是软电离技术，在电离的过程中没有碎片产生，每个峰代表一种化合物，可以同时检测提取液中多个化合物。电喷雾串联质谱能够给出每个离子的碎片，从而提供了丰富的结构信息[3-6]。与电子轰击电离方式不同，电喷雾串联质谱碰撞能量比较小，一般仅从杂原子处断裂失去取代基。我们可以利用这一点探索复杂体系中各种化合物的结构特点，即使不能确定这些化合物的结构，也可以通过其所含的取代基推测其抗氧化性。

糖用甜菜的研究主要集中在制糖方面，对其抗氧化性质研究比较少。Marijana B.Sakac及其合作者对甜菜渣的抗氧化能力进行了系统研究[7]，实验表明甜菜渣的乙醇提取物具有较强的抗氧化能力。我们测定了糖甜菜的水提取液和乙醇提取液对DPPH自由基的清除率，发现其水提取液和乙醇提取液均具有抗氧化性[8]。本文采用电喷雾串联质谱探讨糖甜菜的提取液中各种化学成分的结构，并且将这些结构特点与抗氧化性能结合起来，开创一种研究复杂体系抗氧化性简单有效的新方法。

1 材料与实验方法

1.1 实验材料

糖甜菜块根，栽培品种，由中国农科院甜菜研究所提供。

1.2 仪器与试剂

仪器设备：电喷雾质谱仪为ThermoFisher LCQ fleet（Thermo Fisher Scientific公司），氦气为缓冲气和碰撞气，使用电喷雾源，正离子模式。 仪器条件优化如下，鞘气（sheath gas，氮气）流速：30arbitrary units；喷雾电压（ion spray voltage）：4.0kV；毛细管温度（capillary temperature）：180℃；毛细管电压（capillary voltage）：44V；套管透镜补偿电压（tube lens offset）：50V；注射泵（syringe pump）进样，进样速度为 5μL/min；碰撞能量20%～30%。

主要试剂为甲醇（色谱级，迪马公司），蒸馏水，乙醇（分析纯）。

1.3 糖甜菜的电喷雾质谱研究

1.3.1 样品制备 取糖甜菜鲜样使用锯糊机制成糊状，分别称取5g，分别用50mL水和乙醇超声提取20min，过滤后即得糖甜菜的水和乙醇提取液。

1.3.2 糖甜菜水提取液和乙醇提取液的电喷雾质谱研究 分别取糖甜菜的水和乙醇提取液适量，用甲醇稀释2倍，用0.45μm微孔滤膜过滤。将此溶液直接用于电喷雾质谱正离子和负离子模式检测，注射泵流速5μL/min。

1.3.3 糖甜菜水提取液和乙醇提取液的电喷雾串联质谱研究 根据1.3.2电喷雾一级质谱中产生离子进一步进行串联质谱研究，优化碰撞能量，以谱图中母离子存在的前提下使子离子的丰度最强为最佳状态，碰撞能量为20%～30%。

2 结果与讨论

由于糖甜菜水提液的电喷雾质谱与乙醇提取液的电喷雾质谱中所出现的峰质荷比相同，只是强度有差别，本研究不涉及定量，因此只以糖甜菜水提取液为研究对象。图1是糖甜菜水提取液的正离子、负离子电喷雾全扫描图。正离子谱图中出现的m/z 118、156、235离子是甜菜碱加H、K峰，及其二聚物的加H峰。另外，m/z381、365、292峰也有很强的丰度。与正离子谱相比，负离子谱图比较简单，只有m/z341、m/z555和m/z683峰比较强。其中m/z683离子是m/z341离子二聚体，都是蔗糖分子电离所产生的离子。另外，正谱中的m/z365离子和m/z381离子也是蔗糖分子的电离产物，正谱中的m/z365离子为其加钠离子，m/z381离子是其加钾离子，蔗糖在电喷雾质谱中的表现行为与其含有多个羟基的结构特点是吻合的。由此可见甜菜提取液的主要成分为甜菜碱和蔗糖，另外还含有一些未知成分。

图1 糖甜菜水提取液的ESI-MS（a.正离子模式；b.负离子模式）

为了验证上述推理，对m/z341、365、381这3种离子进行串联质谱研究，如图2、3、4所示。m/z341离子（图2）的子离子主要是m/z179和m/z161分别为[葡萄糖或果糖-H]-和[葡萄糖果糖-H2O-H]-。质谱给出的都是质量数，对于分子量相同的化合物无法区分，因此无法说明这两个子离子是来自葡萄糖还是果糖，但是在自然界中，尤其对于甜菜，这种二聚糖可以确定为蔗糖。m/z365离子（图3）的子离子主要是m/z203和m/z185，分别为[葡萄糖或果糖+Na]+和[葡萄糖果糖-H2O+Na]+。m/z381离子（图4）的子离子主要是m/z219和m/z201离子，分别为[葡萄糖或果糖+K]+和[葡萄糖果糖-H2O+K]+。

除了以上讨论的可以解析出结构的化合物，还有一些未知结构的化合物，这些化合物在电喷雾正离子模式下表现为m/z482、292、104和175离子，在电喷雾负离子模式下表现为m/z555。尽管使用电喷雾质谱解决未知化合物的结构十分困难，但是电喷雾串联质谱图比较简单，便于解析，并且能够给出多级串联质谱，提供丰富的结构信息。通过这些信息，我们可以知道这些化合物的大致结构或含有哪些取代基，通过这些取代基可以初步推断这些化合物的抗氧化性能。这里仅以正离子谱中m/z292和m/z555为例，说明串联质谱在解释未知化合物中的应用。m/z292在串联质谱中产生两个子离子分别为m/z118和175（如图5），这两个离子在一级谱图（图1a）中也存在，说明这个化合物是由甜菜碱和质量数为174的化合物结合而成，再对m/z175进行三级串联质谱（谱图略），发现丢失18、44Da的碎片，分别对应H2O、CO2，说明结构中含有羟基和羧基。m/z555离子在串联质谱中能够失去162、180Da的碎片，说明此化合物结构中含有1个葡萄糖基。另外m/z104的串联质谱也产生18、44Da的碎片（谱图略）。

图4 m/z381离子的ESI-MS2（正离子模式）

图5 m/z292离子的ESI-MS2（正离子模式）

图6 m/z555离子的ESI-MS2（负离子模式）

3 结论

从以上讨论可知，糖甜菜水提取液主要含有甜菜碱和蔗糖，其它未知的化合物分子结构也含有甜菜碱、葡萄糖基、羟基和羧基。葡萄糖中含有多个羟基和1个羰基，具有很高的还原性，具有很好的抗氧化功能。羧基虽然没还原性，但是它能够提供共轭体系，使自由基体系的稳定增强，为化合物的抗氧化性能提供条件。通过电喷雾串联质谱对糖甜菜水提取液的研究，可以得知其中的化学成分均具有抗氧化性，这与DPPH法检测的结果一致，说明使用电喷雾串联质谱法研究糖甜菜的抗氧化性十分可靠，可以作为复杂体系抗氧化性能快速筛选方法。

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[2]张桂芝，耿莎，杨海燕，等.植物抗氧化成分的研究进展[J].食品科学，2007，28（12）：551-553.

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