甲基化试剂对螺旋霉素发酵的影响

罗 俊，高淑红，陈长华，叶蕊芳，武 培，赖 珅，马朝安

(1.华东理工大学生物工程学院 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2.河南天方药业股份有限公司，河南 驻马店 463003)

螺旋霉素[1](Spiramycin，SPM)是十六元大环内酯类抗生素，对于感染性疾病治疗具有临床应用和推广价值，在其它领域也有进一步拓展的空间。其主要成分为螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)、螺旋霉素Ⅱ(SPMⅡ)、螺旋霉素Ⅲ(SPMⅢ)。根据干燥标准品计算，效价应不低于4100 IU·mg-1，其组分要求为：SPMⅠ≤80.0%，SPMⅡ≤5.0%，SPMⅢ≤10.0%；三者的总和应不少于90%。

在螺旋霉素发酵过程中，主要杂质UNK4与主要组分SPMⅠ仅差一个甲基[2]。陈剑锋等[3]在研究甲基化因子对西索米星发酵过程的影响时，发现加快甲基化反应速率有助于增加西索米星前体物质的积累，改变其部分代谢通路，可大大提高发酵组分。氯化胆碱在代谢中与蛋氨酸和甜菜碱类似，可以提供生物化学过程所需要的甲基。因此，作者在此研究了在发酵过程中添加氯化胆碱对发酵产螺旋霉素及组分的影响，进而优化螺旋霉素发酵的培养条件。

1 实验

1.1 仪器

FUS-15L型自动控制发酵罐，华东生物技术工程公司；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机，宁波新芝科学仪器研究所；717 Plus-Auto sampler型HPLC分析仪，Waters公司。

1.2 菌株和培养基

生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)，河南天方药业。

二级种子培养基：糊精，黄豆饼粉，玉米浆，酵母粉，豆油，(NH4)2SO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，CaCO3，pH值6.4。

摇瓶发酵培养基：糊精，黄豆饼粉，玉米浆，酵母粉，豆油，(NH4)2SO4，KH2PO4，NaCl，KCl，Zn2SO4，CoCl2，MgSO4，CaCO3，pH值6.4。

1.3 方法

1.3.1 摇瓶发酵

一级种子培养：250 mL三角瓶装量为30 mL，(27±0.5)℃、220 r·min-1培养48 h。

摇瓶发酵：250 mL三角瓶装量为25 mL，(27±0.5)℃、220 r·min-1培养6 d。

考察了不同甲基化试剂、氯化胆碱添加条件对螺旋霉素发酵的影响。

1.3.2 15 L发酵罐放大实验

将甘油管中的菌种接入500 mL一级种子瓶(27±0.5)℃培养48 h；按相同接种量接入500 mL二级种子瓶，同温培养24 h；再接入15 L发酵罐中培养6 d。一罐为对照罐，即按正常培养基配方进行发酵；一罐为条件罐，即在120 h时添加0.66 g·L-1氯化胆碱。每隔8 h取样，分别测定发酵液的pH值、总糖含量、NH2-N含量、效价，并根据所测参数调节混合料的补加速率。混合料停料时间一般在120 h左右，选择在停料之后添加氯化胆碱，不同批次根据菌体的生长状况调整停料时间，相应的添加氯化胆碱的时间也可以提前。

1.3.3 分析测试

总糖和氨氮含量的测定：采用斐林试剂法和甲醛法[4]。

生物效价和化学效价的测定：参照2010版中国药典，分别采用杯碟法和分光光度法[5]测定。文中所述效价均为生物效价，化学效价测定仅为验证生物效价测定结果。

HPLC法测定发酵液的样品预处理：取一定量螺旋霉素发酵液于3000 r·min-1离心10 min，取上清液于-20℃冷冻保存备用。分析时取1 mL上清液于10 000 r·min-1离心10 min，上清液用0.22 μm合成纤维素聚酯膜真空过滤后即可直接进样。

HPLC法测定发酵组分的色谱条件：流动相A为0.035 mol·L-1的乙酸铵溶液，流动相B为乙腈-甲醇(5∶1)溶液，流动相A和B配制完成后用超声波脱气备用；流动相速度0.8 mL·min-1；柱温70℃；检测器波长232 nm；进样量10 μL；色谱柱：XTerra RP18，5 μm，250 mm×4.6 mm。

HPLC法测定发酵液中有机酸的色谱条件：流动相为10 mmol·L-1磷酸溶液，用K2HPO4溶液调节pH值至2.3±0.1，配制完成后用超声波脱气备用；流动相速度1 mL·min-1；进样量20 μL；检测器波长210 nm；柱温30℃；色谱柱：XTerra RP18，5 μm，250 mm×4.6 mm。

采用以下3种方法对发酵液中的有机酸组分定性：(1)在相同的色谱条件下，将样品色谱图与有机酸标准色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的有机酸；(2)在样品中加入有机酸的标准液，根据峰高的突增来进一步验证色谱峰的归属；(3)比较各有机酸在标准液和发酵液色谱图中的紫外吸收光谱图。

有机酸组分的定量分析：采用HP化学工作站中HP增强型积分算法进行积分，有效控制峰面积测量的精确度。由HPLC图谱积分得出对应各个有机酸峰的峰面积，利用标准曲线换算得到有机酸浓度。

2 结果与讨论

2.1 甲基化试剂对螺旋霉素发酵的影响

96 h为发酵产螺旋霉素的高峰期。因此，在96 h时，向发酵液中分别添加0.8 g·L-1的甲基化试剂叶酸、甲硫氨酸、VB12、氯化胆碱以及甜菜碱，其对螺旋霉素发酵的影响见表1。

表1 甲基化试剂对螺旋霉素发酵的影响

由表1可知，氯化胆碱对螺旋霉素的生物合成有明显的促进作用，叶酸、甲硫氨酸、VB12对螺旋霉素的生产不利，而甜菜碱对螺旋霉素促进效果不明显，其价格也较氯化胆碱昂贵，不利于工业化大生产。因此，选择氯化胆碱作为甲基化试剂进行后续实验。

2.2 氯化胆碱添加条件的优化

2.2.1 氯化胆碱的添加时间

分别在72 h、96 h、120 h时各添加0.4 g·L-1、0.6 g·L-1、0.8 g·L-1、1.0 g·L-1、1.2 g·L-1的氯化胆碱，以不加氯化胆碱作为对照，结果见图1。

氯化胆碱浓度(g·L-1)，1～5：0.4，0.6，0.8，1.0，1.2；6.对照

由图1可知，在发酵72 h时添加氯化胆碱，无论添加量多少均会产生明显的抑制作用，然而随着时间的推后，这种抑制现象逐渐减弱，到发酵中后期(96 h)时，发酵效价随着添加量的增大呈现先增大后降低的趋势；到发酵末期(120 h)时，促进作用很明显，而且只有在高添加浓度下抑制效应才明显。

2.2.2 氯化胆碱的添加浓度

单因子设计(One-factor design，OFD)[6]是一种单因素五水平的实验设计方法。它将实验因素与实验结果的相互关系用多项式近似，并将其函数化，依此研究因素与响应值之间的相互关系，并进行优化。对实验数据进行多项式回归，即可得到一元三次方程，该方程表明因子对响应值的影响。

Y=β0+β1x+β2x2+β3x3

(1)

式中：Y为预测响应值即螺旋霉素的效价；β为回归系数；x为自变量的编码水平。

运用 MyDesign Design Expert 7.0[7]软件对实验数据按式(1)进行方差分析，以得到的复相关系数平方(R2)来表示因子与响应值的拟合性质，并用F检验分析显著水平。对方程求导，便可得到其极值点，即最优化的条件。

采用单因子法设计实验，以氯化胆碱的添加浓度为影响因子(A)、螺旋霉素的效价为响应值，在发酵后期(120 h)添加氯化胆碱，结果见表2。

表2 氯化胆碱添加浓度的单因子实验

对表2数据进行多项式回归分析，拟合三次方程为：

Y=21372.61+3063.67A-2984.72A2-3850.67A3

(2)

实验数据分析见表3。

表3 响应面立方模型分析

由表3可知，该实验模型的P值小于0.05，说明模型是显著的，失真值5.08，模型误差不显著。表4是对模型可信度的分析。

表4 模型可行性分析

由表4可知，信噪比为19.136(软件认为该值大于4即表示模型的可信度较高)，表明该模型能用于指导设计适合的实验范围，R2=0.9850，表明该因素及其多次项能解释Y变化的98.5%，模型拟合程度较好。

通过软件分析，得到氯化胆碱的最优添加浓度为0.66 g·L-1，预计效价可达21 921 U·mL-1。

综上所述，氯化胆碱最优的添加条件为：添加时间为120 h，添加浓度为0.66 g·L-1。添加氯化胆碱后，对螺旋霉素生产有促进作用，摇瓶效价提高15%左右。

2.3 氯化胆碱对摇瓶发酵组分的影响

在120 h时添加浓度为0.66 g·L-1的氯化胆碱，以未添加的作为对照，两组实验分别做5次重复，取平均值，结果见表5。

表5 氯化胆碱对发酵组分的影响/%

由表5可知，添加氯化胆碱之后，各主要杂质含量均有不同程度的降低，而有效组分SPMⅠ的含量也相应有所提升，达到了预期效果。

2.4 氯化胆碱对15 L发酵罐螺旋霉素发酵过程参数的影响

2.4.1 对总糖、氨氮含量的影响(图2)

图2 添加氯化胆碱后总糖与氨氮的走势

由图2可知，两批罐采用同种生产工艺控制，两批罐的总糖、氨氮含量走势基本一致。

2.4.2 对pH值、效价的影响(图3)

图3 添加氯化胆碱后pH值与效价的走势

由图3可知，在120 h添加氯化胆碱后，条件罐pH值快速下降，在128 h后趋于稳定，pH值稳定在5.9左右；而对照罐pH值则变化不大，稳定在6.2左右，这可能和氯化胆碱是弱酸性溶液有关。

由图3还可知，进入生产末期后，对照罐的效价增长速度逐渐放缓，而条件罐在添加氯化胆碱后，效价一直稳步提升。

2.4.3 对螺旋霉素组分时序性的影响(表6)

表6 氯化胆碱对螺旋霉素时序性的影响

由表6可知，在120 h添加0.66 g·L-1氯化胆碱后，各主要杂质组分的含量均有一定程度的降低，其中杂质UNK4的含量变化显著，由对照罐的2.11%降至1.18%，其它杂质UNK2由6.57%降至6.35%、杂质B由1.17%降至0.55%，对应的有效组分SPMⅠ的含量由85.56%提升至89.98%。

2.4.4 对代谢过程中有机酸的影响(图4)

图4 发酵过程中有机酸浓度的变化趋势

由图4可知，补加氯化胆碱后，与对照罐相比，条件罐的丙酮酸浓度降低，丙酸浓度基本不变，柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、苹果酸以及乙酸浓度均有不同程度的提高，其中柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及苹果酸均为TCA循环中的重要代谢中间产物，它们均有不同程度的积累，说明氯化胆碱的加入有助于增大TCA循环通量。

葡萄糖进入细胞以后，首先经过EMP代谢途径转化为丙酮酸后，才能进一步进入TCA循环，丙酮酸浓度的变化一定程度上可以反映菌体对糖的利用情况。胞内生成的丙酮酸主要转化为乙酰CoA和草酰乙酸，丙酮酸浓度的降低说明该转化向草酰乙酸进行，而草酰乙酸为生成丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的主要底物，不仅提供了内酯环合成所需要的三碳前体，同时还能缓解底物抑制效应，使多余的二碳前体(如乙酰CoA和丙酰CoA)能够在酰基羧化酶的作用下进一步转化成为丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA，促进大环合成，提高生物效价。

3 结论

通过添加甲基化试剂，使得摇瓶发酵产生螺旋霉素的产量和发酵液中有效组分含量得到了提高。氯化胆碱的最优添加时间为120 h、最优添加浓度为0.66 g·L-1，此条件下螺旋霉素效价提高约15%，各主要杂质的含量均有一定程度的降低，其中UNK4的含量变化最显著，而有效组分的含量相应有所提升。

同样条件下，在15 L发酵罐放大实验中添加氯化胆碱，各主要杂质组分的含量均有一定程度的降低，其中杂质UNK4变化最显著，由对照罐的2.11%降至1.18%，有效组分的含量也由85.56%提升至89.98%。

[1] 朱峰，王尔健.螺旋霉素的再评价[J].中国抗生素杂志，1991，16(3)：231-236.

[2] Murali Pendela.Characterization of impurities in spiramycin by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J].Rapid Communication in Mass Spectromery，2007，21(4)：599-613.

[3] 陈剑锋，王航，张元兴，等.促甲基化因子对西索米星发酵的影响[J].微生物学通报，2006，33(4)：85-90.

[4] 刘刚，徐志南，徐蓉，等.磷酸镁对螺旋霉素发酵的影响[J].中国抗生素杂志，1999，22(3)：231-233.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：化学工业出版社，2010：附录81.

[6] 胡蓉.丙三醇对螺旋霉素生物合成过程的影响[J].华东理工大学学报，2009，35(1)：30-34.

[7] 平芮巾.响应面法优化海洋细菌MP-2酯酶发酵条件[J].应用与环境生物学报，2008，14(4)：548-552.