螺旋链霉菌的推理选育

邹 娟，叶蕊芳，郑 黎，吴 阳，张 立，戴 维

(1.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2.河南天方药业股份有限公司，河南 驻马店 463003)

螺旋霉素(Spiramycin，SPM)是螺旋链霉菌(Streptomycesspiramyceticus)发酵产生的次级代谢产物，属于十六元大环内酯类抗生素，主要抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、立克次氏体和大型病毒等，对于感染性疾病治疗具有临床应用和推广价值[1]。据文献报道，螺旋霉素的菌种选育采用过紫外线(UV)、Co60射线、NTG等诱变方法，均筛选出了高产菌株[2～4]。但是各种诱变方法的比较尚未见文献报道。

王筱兰[5]利用螺旋霉素的前体L-甲硫氨酸和L-缬氨酸类似物L-乙硫氨酸和L-α-氨基丁酸进行定向筛选，达到高通量筛选效果。螺旋霉素的十六元大环骨架是由乙酸、丙酸、丁酸等前体缩合而成，丙二酸钠可以作为它的一个3C前体结构类似物，乙酰胺可以作为一个2C前体结构类似物，两者可以用来高通量筛选螺旋链霉菌。

作者分别采用物理诱变、化学诱变、复合诱变处理同一出发菌株，比较各种处理手段对螺旋链霉菌的诱变效果以及对其稳定性的影响，找出最佳的螺旋链霉菌诱变手段，拟为深入研究螺旋链霉菌的诱变选育提供一定的理论指导。

1 实验

1.1 菌株

螺旋链霉菌25-1(出发菌株)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，生物效价测定用)，河南天方药业股份有限公司。

1.2 培养基和培养条件

斜面和分离培养基(%)：淀粉4.0，黄豆饼粉2.0，玉米浆0.5，蛋白胨0.5，NaCl 0.2，CaCO30.5，琼脂粉2.0，pH值6.4，27℃倒置培养12 d，相对湿度30%～50%。

种子培养基(%)：淀粉 4.0，黄豆饼粉 2.0，玉米浆 0.5，蛋白胨 0.5，NaCl 0.2，CaCO30.5，pH值6.4，27℃、220 r·min-1下旋转摇床培养2 d。

发酵培养基(%)：淀粉 7.0，黄豆饼粉 1.0，玉米浆 1.5，鱼粉 1.5，MgSO40.1，NH4NO30.6，KH2PO40.1，NaCl 0.8，CaCO30.5，豆油 0.4，pH值6.4，27℃、220 r·min-1下旋转摇床培养4 d，接种量6%。

生物效价测定用培养基(%)：蛋白胨 0.6，酵母粉 0.15，牛肉膏 0.2，葡萄糖 0.3，琼脂粉上层0.9%、下层1.2%，pH值7.8～8.0，37℃恒温隔水培养箱培养16～18 h。

1.3 诱变处理方法

1.3.1 菌悬液的制备

螺旋链霉菌25-1从斜面接入(菌量为0.15 cm2)到装液量为30 mL的250 mL摇瓶种子培养基中培养2 d，在无菌条件下吸取8 mL种子液离心(3500 r·min-1，10 min)，弃上清，再用8 mL无菌生理盐水清洗菌体1次，离心弃上清，吸取10 mL无菌生理盐水稀释菌体，混匀，制成菌悬液，备用。

1.3.2 紫外诱变处理

取5 mL菌悬液倒入装有少许玻璃珠的50 mL三角锥形瓶中，振荡20 min混匀，将菌悬液倒入带磁力针的平板里，置于紫外灯箱内的磁力搅拌器上，分别开盖搅拌照射90 s、120 s、150 s。紫外照射条件：波长253.7 nm，功率15 W，垂直距离30 cm。为避免光修复作用，照射过程不能在日光灯下操作。吸取紫外处理过的菌液，稀释，均匀涂布在平板上，以未处理的菌悬液作为对照，于27℃倒置培养12 d接斜面筛选。

1.3.3 Co60射线诱变处理

取装有3 mL菌悬液的小试管3支，分别用150 000 rad、200 000 rad、250 000 rad强度的Co60射线处理，取出，稀释，均匀涂布在平板上，以未处理的菌悬液作为对照，于27℃倒置培养12 d接斜面筛选。

1.3.4 EMS诱变处理

吸取5 mL菌悬液接入装有玻璃珠的50 mL三角锥形瓶中，加入25 μL EMS，于27℃、220 r·min-1下分别振荡2 h、4 h、6 h，稀释，均匀涂在平板上，以未加入EMS的自然分离组作为对照，于27℃倒置培养12 d接斜面筛选。

1.3.5 LiCl诱变处理

取5 mL菌悬液用1%LiCl处理3 h、6 h，稀释，均匀涂布在平板上，以未处理的菌悬液作为对照，于27℃倒置培养12 d接斜面筛选。

1.3.6 LiCl+UV诱变处理

菌悬液先用1%LiCl处理3 h后再紫外照射120 s，稀释，均匀涂布在平板上，以未处理的菌悬液作为对照，于27℃倒置培养12 d接斜面筛选。

1.3.7 NTG+UV诱变处理

(1)TM缓冲溶液(Tris-马来酸缓冲溶液)的配制：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.121 g、马来酸(顺丁烯二酸)0.116 g，加20 mL蒸馏水配成0.05 mol·L-1Tris-马来酸缓冲溶液，调节pH值至9.0，121℃下灭菌5 min。

(2)诱变过程：称取4 mgNTG于灭菌的50 mL离心管内，加入1～2滴甲醇使NTG完全溶解，再加入2 mL TM缓冲溶液，使NTG浓度为2 mg·mL-1。吸取2 mL菌悬液加入到装有NTG溶液的离心管中，此时NTG浓度为1 mg·mL-1。将离心管置于装有棉花或者纱布的三角瓶中，于27℃摇床培养90 min。然后将NTG处理过的菌悬液以8000 r·min-1离心10 min，弃去上清液(上清液需要用1 mol·L-1NaOH处理)，加入5 mL生理盐水洗涤，再以8000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，在离心管中加入2 mL生理盐水，即为处理原液。以未处理的菌悬液和0.1 mL处理原液作为对照，其余处理原液紫外照射60 s，稀释，涂平板，于27℃倒置培养12 d。

所有接触过NTG的用具用1 mol·L-1的NaOH处理数小时。

1.4 高通量筛选方法

1.4.1 丙二酸钠抗性突变菌株的筛选

取处理后的菌悬液稀释不同倍数，均匀涂布在含3%、4%、5%、6%、7%、8%丙二酸钠的分离平板上，周期延长4 d，于27℃倒置培养16 d。观察菌株生长情况，挑选饱满单菌落进行初筛，并选高产菌株进行复筛。

1.4.2 乙酰胺抗性突变株的筛选

取处理后的菌悬液稀释不同倍数，均匀涂布在含0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%乙酰胺的分离平板上，周期延长2 d，于27℃倒置培养14 d。观察菌株生长情况，挑选饱满单菌落进行初筛，并选高产菌株进行复筛。

各诱变参数按下式计算：

1.5 螺旋霉素效价测定[6]

参照2005年版中国药典，采用管碟法测定螺旋霉素的生物效价。实验中同一条件的发酵均为3瓶重复，效价为3瓶平均值，误差小于5%。

2 结果与讨论

2.1 不同诱变方法效果及比较

2.1.1 紫外诱变效果

平板上的菌落长好后，随机挑取230株突变菌进行初筛，并计算各参数，结果见表1。

从表1可知，紫外线处理菌株后致死率、最大提高幅度、正变率均高于未处理菌株，120 s的致死率为80.00%、正变率高达43.10%、最大提高幅度达28.21%，而90 s和150 s的最大提高幅度和正变率相对较低，说明紫外线诱变120 s对螺旋链霉菌的效果最好。

表1 紫外诱变不同时间的结果

2.1.2 Co60射线诱变效果

平板上的菌落长好后，挑取230株突变菌进行初筛并计算各参数，结果见表2。

表2 Co60射线诱变不同剂量的结果

从表2可知，随着Co60照射剂量的增加，最大提高幅度和正变率降低，说明高剂量处理使菌株向不利于合成螺旋霉素的方向突变，150 000 rad剂量下对螺旋链霉菌的诱变效果最好，最大提高幅度高达29.03%。

2.1.3 EMS诱变效果

平板上的菌落长好后，挑取230株突变菌初筛并计算各参数，结果见表3。

表3 EMS诱变不同时间的结果

从表3可知，EMS诱变的最大提高幅度和正变率均较高，说明EMS诱变对螺旋链霉菌合成螺旋霉素很有利，EMS诱变4 h的效果最好，最大提高幅度达37.99%。

2.1.4 LiCl诱变效果

平板上的菌落长好后，挑取200株突变菌初筛并计算各参数，结果见表4。

从表4可知，LiCl处理螺旋链霉菌后的最大提高幅度和正变率与自然分离效果差不多，说明单独用LiCl诱变螺旋链霉菌的效果不是很明显。

表4 LiCl诱变不同时间的结果

2.1.5 LiCl+UV复合诱变效果

平板上的菌落长好后，挑取200株突变菌初筛并计算各参数，结果见表5。

表5 LiCl+UV复合诱变的结果

从表5可知，LiCl+UV复合诱变的最大提高幅度达31.55%、正变率达47.60%，比单独用UV诱变120 s效果更好，说明LiCl+UV复合诱变对螺旋链霉菌效果较好。

2.1.6 NTG+UV复合诱变效果

平板上的菌落长好后，挑取200株突变菌初筛并计算各参数，结果见表6。

表6 NTG+UV复合诱变的结果

从表6可知，NTG+UV复合诱变致死率较高，但最大提高幅度和正变率不高，推测NTG诱变使螺旋链霉菌大量死亡，并不利于其向高产量方向突变。

2.1.7 不同诱变方法比较

选取6种处理方法中各诱变效果最好的剂量，进行致死率、正变率和最大提高幅度比较，结果见表7。

表7 6种诱变方法效果比较/%

由表7可知，除LiCl以外，其余诱变方法的致死率都在80%左右，其中UV、EMS和LiCl+UV的正变率超过40%，最大提高幅度也高，Co60射线正变率和NTG+UV差不多，但最大提高幅度达29.03%，故得出UV、Co60射线、EMS、LiCl+UV 4种处理方法对螺旋链霉菌的诱变效果较好。

2.2 不同高通量筛选方法效果

2.2.1 丙二酸钠抗性突变株的筛选及结果

丙二酸钠浓度对菌株生长的影响见表8。

表8 丙二酸钠浓度对菌株生长的影响

由表8可知，添加丙二酸钠对菌落生长量和形态影响很大，随着丙二酸钠浓度的增加，菌株生长量减少，菌落长得更小、颜色更浅，最低致死浓度为7%，故选用6%作为丙二酸钠定向筛选的浓度。

6%丙二酸钠法筛选结果见表9。

表9 丙二酸钠法筛选结果

从表9可知，6%丙二酸钠筛选出的菌株效价提高10%以上，且较稳定，说明丙二酸钠可作为螺旋链霉菌的高通量筛选剂。

2.2.2 乙酰胺抗性突变株的筛选及结果

乙酰胺浓度对菌株生长的影响见表10。

表10 乙酰胺浓度对菌株生长的影响

从表10可知，添加乙酰胺对菌株生长量和形态影响很大。随着乙酰胺浓度的增加，菌株生长量减少，菌2.0%乙酰胺法筛选结果见表11。

表11 乙酰胺法筛选结果

从表11可知，乙酰胺对效价影响不明显。原因在于乙酰胺会显著减少菌株生长量，故不适合作为螺旋链霉菌的高通量筛选剂。

2.3 各诱变方法对螺旋链霉菌稳定性比较

分别采用6种方法诱变和丙二酸钠法定向筛选菌株，各选3株相对高产菌株进行3代斜面转接，每一代以3株菌的相对效价平均值为基准，以第1代相对效价为100%，考察各诱变方法对螺旋链霉菌的稳定性。结果见图1。

图1 各诱变方法对螺旋链霉菌的稳定性比较

从图1可知，各诱变方法高产菌株传代3次后稳定性依次为：Co60射线>UV>丙二酸钠法筛选>LiCl>LiCl+UV>EMS>NTG+UV。这说明物理诱变剂对螺旋链霉菌的稳定性影响不大，而化学诱变剂对螺旋链霉菌稳定性影响较大。推测螺旋链霉菌本身合成螺旋霉素质粒不稳定，而EMS和NTG为强诱变剂，可能对其影响较大。结合表7各诱变方法致死率、正变率和最大提高幅度的比较，得出UV、Co60射线、LiCl+UV 3种方法对螺旋链霉菌诱变效果最好，而丙二酸钠用于螺旋链霉菌的筛选效果较好。

3 结论

(1)对于螺旋链霉菌，UV、Co60射线和LiCl+UV 3种诱变方法的诱变效果较好；丙二酸钠作为螺旋链霉菌的高通量筛选剂，能获得较好的效果，提高了筛选的效率。

(2)化学诱变剂EMS和NTG对螺旋链霉菌突变效果明显，但对菌株的稳定性影响较大。

(3)LiCl单独使用对螺旋链霉菌的诱变效果不明显，但与紫外诱变共同使用，有增强作用，可以考虑与其它诱变效果好的方法共同使用。

[1] Webster Carol，Ghazanfar Katayoun，Slack Richard.Subinhibitory and post-antibiotic effects of spiramycin and erythromycin onStaphylococcusaureus[J].Antimicrob Chemother，1988，22(SuppleB)：33-39.

[2] 金志华，宋有礼，黄纯农.螺旋霉素产生菌螺旋霉素链霉菌遗传育种[J].中国抗生素杂志，1992，17(4)：265-270.

[3] 叶蕊芳，郑黎.螺旋霉素产生菌抗噬菌体菌株的选育[J].华东理工大学学报(自然科学版)，1997，23(5)：545-549.

[4] Ford L M，廖富荣，译.螺旋霉素的高产生二素链霉菌突变株的选育及最适生产条件的确定[J].国外医药抗生素分册，1992，19(6)：404-406.

[5] 王筱兰.螺旋霉素产生菌菌种选育[J].南昌大学学报(工科版)，1994，16(9)：61-65.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：化学工业出版社，2005：附录Ⅱ-Ⅺ.