重组运动发酵单胞菌发酵木糖产乙醇的研究

周 稳，付 烈，王俊卿，熊 平，汪浩勇

(湖北工业大学生物工程学院，湖北 武汉 430068)

燃料乙醇作为能源具有污染小、可再生等诸多优点，各国均致力于提高燃料乙醇生产效率的研究[1]。酿酒酵母是目前发酵生产燃料乙醇的主要菌种，但其生长慢、发酵周期长、耐乙醇能力较差，难以用于高浓度乙醇的发酵生产[2]。而运动发酵单胞菌具有发酵周期短、糖类转化率高、耐乙醇能力强以及遗传改造简单等特点，是良好的燃料乙醇生产菌种[3]。

大肠杆菌能利用戊糖和己糖，但缺乏相关高效率乙醇代谢酶，几乎不产生乙醇[4]。运动发酵单胞菌只能利用葡萄糖、果糖以独特的ED途径生成乙醇[5]。自然界最丰富的是纤维素[6]，其水解液的主要成分为己糖(葡萄糖、半乳糖)以及大量的戊糖等，其中木糖是戊糖最主要的成分。如果运动发酵单胞菌能发酵纤维素水解液生产廉价的燃料乙醇，对解决未来能源短缺具有重大意义和潜在价值[7，8]。

作者通过基因工程手段用大肠杆菌的木糖代谢基因xylA、xylB、tktA、talB构建木糖代谢和利用转座载体pXT，转座运动发酵单胞菌而使其获得发酵木糖产乙醇的新代谢途径，获得了能同时利用葡萄糖和木糖高效生产乙醇的基因工程重组菌。

1 实验

1.1 菌株、试剂和培养基

1.1.1 菌株(表1)

表1 4种实验菌株

ZM-CP4来自ZM ATCC31821；ZM-hym和大肠杆菌E.coliDH5α，由作者所在实验室保藏；运动发酵单胞菌不能合成两种氨基酸：赖氨酸和甲硫氨酸[9]。作者所在实验室前期已构建了含有赖氨酸合成酶基因(YfdZ)、甲硫氨酸合成酶基因(MetB)和热休克蛋白基因(Hsp)的转座载体pHYM，通过转座重组原始菌ZM-CP4得到了重组菌ZM-hym。

ZM-xt：用木糖代谢和利用转座载体pXT转座重组原始菌ZM-CP4，得到ZM-xt，作为对照菌；

ZM-mtc9xt：用木糖代谢和利用转座载体pXT转座重组菌ZM-hym，得到ZM-mtc9xt。

1.1.2 试剂

Pfu DNA聚合酶，NEB公司；T4DNA连接酶和各种限制性内切酶，大连宝生物公司；质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒，长沙安比奥生物技术公司；酵母粉，Sigma公司；葡萄糖、木糖、氯化镁以及各种抗生素等试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基及培养条件

LB培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，固体培养基添加2%琼脂，121℃灭菌30 min。

ZM培养基：10%葡萄糖，0.1%尿素，1%酵母粉，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，固体培养基添加2%琼脂，pH值6.0，115℃灭菌20 min。

发酵培养基：0.1%尿素，1%酵母粉，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，随发酵条件添加不同浓度糖溶液，pH值6.0，115℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 DNA操作方法

细菌基因组DNA的提取、PCR产物及DNA片段的纯化，质粒DNA提取、酶切、连接、转化以及各种感受态细胞的制备等参照文献[10]进行。质粒DNA的小量提取和纯化参照试剂盒操作说明。

1.2.2 转座载体pXT的构建

以大肠杆菌E.coliK12基因组为模板，通过PCR扩增获得大肠杆菌木糖代谢相关基因xylA、xylB、tktA和talB，其大小分别为1.4 kb、1.5 kb、1.4 kb和2.0 kb。以野生型运动发酵单胞菌基因组DNA为模板，PCR 扩增获得gap和eno基因启动子序列片段，其大小分别为0.25 kb和0.2 kb。利用PCR重叠技术，将gap基因启动子序列和xylA/xylB基因序列融合，片段大小为3.2 kb。将eno启动子序列和talB/tktA基因序列融合，片段大小为3.6 kb。将克隆的融合片段连接到运动发酵单胞菌转座载体上构建木糖代谢和利用转座载体pXT。

1.2.3 转座

在大肠杆菌中构建好转座载体pXT后，取10 μL转座载体与5 μL转座酶混合，37℃水浴2 h，取3 μL与ZM-CP4或ZM-hym混合，电击后于ZM培养基中32℃培养4 h后涂板。转座载体pXT分别转入ZM-hym和原始菌ZM-CP4获得基因工程菌ZM-mtc9xt及ZM-xt。

1.2.4 重组菌株筛选

1.2.4.1 木糖平板筛选

将电击转座后的细菌加入1 mL ZM培养基培养4 h后，离心去上清，用无菌生理盐水稀释，涂布以3%木糖为唯一碳源并含有1‰四环素的固体培养基上，32℃厌氧罐中培养3 d以上。同等条件下以未转化的原始菌ZM-CP4及ZM-hym作为对照。

挑取木糖板上长出的转座子接种于50 mL ZM培养基中培养24 h后，抽取基因组DNA，设计4对检验引物，分别对木糖代谢基因xylA、xylB、tktA、talB进行PCR鉴定，大小应为0.48 kb、0.73 kb、0.55 kb、0.81 kb。同样条件下以ZM-CP4及ZM-hym的基因组DNA作为对照。PCR鉴定正确的阳性转座子加入等体积的40%灭菌甘油，于-80°C冰箱中低温保存。

1.2.5 发酵实验

(1)单糖发酵：取PCR鉴定正确的细菌各1 mL接种于9 mL ZM培养基中，24 h后按10%的接种量分别接入含23%葡萄糖或含6%木糖的发酵培养基中，密封，32℃、60 r·min-1振荡培养60 h，测乙醇产量。

(2)混合糖发酵：取各保藏实验菌株1 mL接种于9 mL ZM培养基中，24 h后按10%的接种量接入含17%葡萄糖+6%木糖的混合糖发酵培养基中，密封，32℃、60 r·min-1振荡培养60 h，测乙醇产量。

考察了温度(32℃、40℃)、培养基中酵母粉浓度(质量体积比，分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)对混合糖发酵的影响。

1.2.6 乙醇产量测定

对照组尿潴留发生率为27.59%,相比于研究组的6.89%高出许多,统计学存在差异(P<0.05),结果如下表1:

乙醇产量采用GC7890F型气相色谱仪(上海天美有限公司)测定，以异丁醇作为内标物。

2 结果与讨论

2.1 重组菌种的初筛与PCR鉴定

重组菌在以3%木糖为唯一碳源的培养基上的生长情况见图1。

图1 重组菌在以3%木糖为唯一碳源的培养基上的生长情况

由图1可知，转座后的细菌涂布木糖板72 h后，板上长出少量白色菌落，而未转座的原始菌ZM-CP4及ZM-hym木糖板上未见白色菌落生长。

重组菌基因组DNA的PCR鉴定结果见图2。

图2 重组菌基因组PCR鉴定(左：ZM-mtc9xt；右：ZM-xt)

由图2可知，1%的琼脂糖凝胶电泳显示，4对检验引物扩增的PCR片段大小分别约为0.5 kb、0.8 kb、0.6 kb、0.8 kb，与设计相符。而原始菌ZM-CP4及ZM-hym基因组DNA的PCR鉴定结果均为阴性，表明两种重组菌中确实包含木糖代谢基因xylA、xylB、tktA和talB。共获得76个转座阳性细菌。

2.2 23%葡萄糖发酵实验和6%木糖单糖发酵实验结果

所获得的76个转座阳性细菌中，有些不能利用葡萄糖，有些利用葡萄糖发酵乙醇能力大幅度下降。实验只保留能高效生成乙醇的转座阳性菌株。经过4轮筛选，共获得8个能高效利用葡萄糖发酵生成乙醇的转座阳性菌株，其在23%葡萄糖、6%木糖发酵培养基中发酵产乙醇的情况见图3、图4。

图3 各菌株23%葡萄糖发酵实验

图4 各菌株6%木糖发酵实验

由图3可知，在含23%葡萄糖的发酵条件下，重组菌ZM-xt2和ZM-mtc9xt1最高乙醇产量分别为102.7 g·L-1和98.3 g·L-1，而原始菌ZM-CP4和ZM-hym的乙醇平均产量分别为97.2 g·L-1和106.4 g·L-1。虽然重组菌的乙醇产量略低于ZM-hym，但却高于原始菌ZM-CP4，这可能是由于转入了新的基因使得细菌的能量代谢负担加重，乙醇产量有少许下降。但对重组菌高效发酵葡萄糖产乙醇的能力没有影响。

原始菌ZM-CP4和ZM-hym在木糖发酵培养基内不能生长，而重组菌ZM-xt(1～4)和ZM-mtc9xt(1～4)均能在木糖发酵培养基内正常生长。由图4可知，在6%木糖发酵培养基中发酵60 h后，ZM-xt(1～4)和ZM-mtc9xt(1～4)均能发酵木糖产乙醇，但各菌株发酵木糖产乙醇的能力各不相同，其中ZM-xt1和ZM-mtc9xt3发酵能力最强，乙醇产量分别为24.9 g·L-1和24.1 g·L-1。

综上可知，ZM-xt1和ZM-mtc9xt3在6%木糖发酵培养基中乙醇产量最高且能高效发酵23%葡萄糖，因此用ZM-xt1和ZM-mtc9xt3进行后续实验。

2.3 17%葡萄糖+6%木糖混合糖发酵实验结果(图5)

图5 各菌株17%葡萄糖+6%木糖发酵实验

由图5可知，在混合糖发酵条件下，原始菌ZM-CP4和ZM-hym的平均乙醇产量分别为72.7 g·L-1和75.3 g·L-1。ZM-xt1的平均乙醇产量为83.8 g·L-1，与ZM-CP4和ZM-hym相比，分别提高了15%和12%。ZM-mtc9xt3的平均乙醇产量为88.9 g·L-1，与ZM-CP4和ZM-hym相比，分别提高了22%和18%。该结果表明，大肠杆菌的木糖代谢和利用基因，能在运动发酵单胞菌中与运动发酵单胞菌的ED途径相偶联，利用木糖产乙醇，提高了混合糖发酵的乙醇产量。

2.4 温度对混合糖发酵的影响(图6)

图6 温度对混合糖发酵的影响

由图6可知，在17%葡萄糖+6%木糖混合糖发酵时，与32℃发酵相比，40℃时各菌株的乙醇产量均有所下降。原始菌ZM-CP4与ZM-xt1的平均乙醇产量分别降低了47%和48%，而含有Hsp基因的ZM-hym和ZM-mtc9xt3平均乙醇产量仅分别降低6%和9%。由此可知，含有Hsp基因的重组菌ZM-mtc9xt3对温度的耐受性显著提高。

2.5 酵母粉浓度对混合糖的影响(图7)

图7 酵母粉浓度对混合糖发酵的影响

由图7可知，在酵母粉浓度为0～0.4%时，各菌株的乙醇产量差别不明显。在酵母粉浓度为0.4%～0.8%时，ZM-mtc9xt3乙醇产量增加了60.4 g·L-1，ZM-hym乙醇产量增加了55.4 g·L-1，ZM-xt1乙醇产量增加了45.6 g·L-1，而原始菌乙醇产量仅增加39.6 g·L-1。含有hym基因的ZM-mtc9xt3乙醇产量分别比ZM-xt1和原始菌ZM-CP4提高了32%和53%。说明在hym基因的作用下，ZM-mtc9xt3比ZM-xt1和原始菌ZM-CP4更能适应在低酵母粉浓度的混合糖发酵培养基中发酵生产乙醇。在酵母粉浓度为0.8%～1.0%时，菌株ZM-xt1和原始菌ZM-CP4乙醇产量才开始迅速增加，而ZM-mtc9xt3和ZM-hym的乙醇产量则增加平缓。但由于混合糖培养基中还含有6%木糖，整合了木糖代谢和利用基因的ZM-mtc9xt3最终乙醇产量比ZM-hym提高了9%。说明在低营养物酵母粉浓度的葡萄糖和木糖混合糖发酵培养基中，ZM-mtc9xt3更能有效地利用各种糖发酵产乙醇。

3 结论

近年来，在关于运动发酵单胞菌发酵木糖产乙醇的相关报道中，研究人员多采用穿梭质粒转化细菌[11]，但其发酵性能不稳定，且需加入各种抗生素维持[12，13]。本实验首次将外源基因xylA、xylB、tktA和talB通过转座方式整合到运动发酵单胞菌的基因组DNA上，通过筛选得到能发酵木糖高效产乙醇的重组菌ZM-mtc9xt3，在17%葡萄糖+6%木糖混合糖发酵中乙醇产量为88.9 g·L-1，比原始菌ZM-CP4提高了22%。且所构建的重组菌ZM-mtc9xt3能在较低营养条件和较高温度下高效发酵产乙醇，更适于工业化应用，有望生产低成本廉价乙醇。

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