应用球面对称设计优化两相体系生物转化合成5-氟尿苷

倪孟祥，赵 雨

(中国药科大学微生物制药教研室，江苏 南京 210009)

5-氟尿苷(5-FUR) 是抗肿瘤核苷药物脱氧氟尿苷(DFUR) 的合成中间体。脱氧氟尿苷是一种抗代谢类抗肿瘤药，在体内可以部分转化为氟尿嘧啶(FU)，二者具有相似的作用途径和抗肿瘤谱[1]。脱氧氟尿苷的抗肿瘤活性高且毒副反应小，主要用于治疗晚期结直肠癌和各种类型肝癌。目前，国内主要采用化学法合成脱氧氟尿苷，由于该法产物为多种核苷异构体和其它副产品的混合物，需要进一步分离，因此耗时费力、收率很低(约10%)。

1980 年，Utagawa 等首次报道了一种比化学法更为简单、快速的酶合成法。这种方法主要是利用某些微生物中存在核苷磷酸化酶，它能催化一种核苷的碱基与另一种碱基互换，生成新的核苷[2]。酶法合成5-氟尿苷的反应过程如下：

5-氟尿嘧啶(5-FU)难溶于水，在转化实验中受溶解度限制虽转化率较高但产量较低，本实验室通过水/有机溶剂两相体系[3]转化解决这一问题。对于反应物为难溶物质的生物转化反应，可用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂、提高溶解度实现生物转化[4]。

球面对称设计是在球面设计的基础上，实验点分布在球面各卦限内中心点和球面与坐标轴的交点上，而以球心作为中心对照点的一种实验设计[5]。球面对称设计的优点是实验次数与正交实验相当，但实验精度高，并且由此得到的关系式可以确定任何范围内实验点的预测值，对于需要控制指标和多指标的实验，效果尤为显著，因此已广泛应用于药物制剂配方优化、发酵条件优化、药物提取工艺优化等[6]。

作者在此应用球面对称设计研究了水/有机溶剂两相体系对嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28+(PyNPase)生物转化5-氟尿嘧啶为5-氟尿苷的影响。

1 实验

1.1 菌种与培养基

菌种：嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28+(PyNPase)，自行构建并保存。

LB培养基：蛋白胨1 g，酵母浸出液0.5 g，NaCl 0.5 g，溶解于100 mL 2.5 mmol·L-1的PBS中，121 ℃灭菌20 min，置于烘箱中干燥，在超净台中控制好温度加入40 μL 40 μg·mL-1卡那霉素。摇匀，倒入平板，冷却后于37 ℃培养箱中保存。

20%玉米浆储液的制备：取200 g干燥的玉米浆干粉，加1 L自来水加热溶解，冷却，用饱和NaOH溶液调pH值至7.0，过滤除沉淀，121 ℃灭菌20 min。重新调pH值至7.0，过滤，补水至1 L后再次灭菌，于4 ℃冰箱中保存。

玉米浆培养基：玉米浆储液20 mL，牛肉膏1.5 g，KH2PO4·2H2O 0.019 g，Na2HPO4·12H2O 0.129 g，溶解于80 mL 2.5 mmol·L-1的PBS中调pH值至7.2，121 ℃灭菌20 min。接种前加40 μL 40 μg·mL-1卡那霉素。

发酵培养基：玉米浆储液20 mL，牛肉膏1.5 g，KH2PO4·2H2O 0.019 g，Na2HPO4·12H2O 0.129 g，NaCl 0.1 g，MgSO40.02 g，CaCl20.04 g，ZnSO40.004 g，硼酸钠0.004 g，溶解于80 mL 2.5 mmol·L-1的PBS中调pH值至7.2，121 ℃灭菌 20 min。接种前加40 μL 40 μg·mL-1卡那霉素。

1.2 试剂与仪器

尿苷，上海聚缘生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶，上海瀚鸿生化有限公司；5-氟尿苷标准品，美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国；台式水浴恒温振荡器，太仓市光明分析仪器厂；7522G型分光光度计，上海第三分析仪器厂；ISF-1-W型摇床，瑞士科耐。

1.3 方法

1.3.1 菌体培养

挑取平板上的E.coliBL21单菌落接种于装有玉米浆培养基的摇瓶中进行种子液培养，于37 ℃、200 r·min-1培养16 h；再按1%的接种量接种于装有发酵培养基的摇瓶中，于37 ℃、200 r·min-1培养8 h，加入50 μL 0.05 mmol·L-1IPTG，于31 ℃、200 r·min-1培养10 h。

1.3.2 湿菌体的制备

培养液在4 ℃、8000 r·min-1冷冻离心8 min，弃上清，沉淀加入10 mmol·L-1pH值为7.0的PBS重悬，EP管分装，于12 000 r·min-1离心8 min，弃上清及上层黑色物质。精确称重，于4 ℃冰箱保存，备用。

1.3.3 5-氟尿苷标准曲线的绘制

精密称取一定量的5-氟尿苷标准品粉末，以纯净水溶解制成浓储液，再以一定比例稀释，HPLC检测，绘制标准曲线。

1.3.4 单水相体系微生物转化反应

取10 mmol·L-1尿苷、46 mmol·L-15-氟尿嘧啶、0.7 g·L-1湿菌体，以40 mmol·L-1PBS(pH值为7.4，下同)为溶剂，混匀，于50 ℃、150 r·min-1振荡反应1 h后加入1/3体积的200 mmol·L-1盐酸或者放置冰箱冷却10 min，终止反应，用0.22 μm微孔滤膜过滤，HPLC分析产物。

1.3.5 两相体系微生物转化反应

取20 mmol·L-1尿苷、不同体积分数DMSO的饱和5-氟尿嘧啶溶液、1.4 g·L-1湿菌体，以DMSO和40 mmol·L-1PBS为溶剂，混匀，后续操作同1.3.4。

1.4 分析测试

菌体生长量的测定：以空白不接菌种的培养基为对照，测定OD600。

5-氟尿嘧啶溶解度的测定：以结晶析出法测定室温时的溶解度。溶剂为DMSO、正己烷、叔丁醇、PBS、不同体积比的DMSO与PBS的混合溶液。

5-氟尿苷产量的测定：HPLC法。测定条件：采用汉邦C18柱，流动相为50 mmol·L-1磷酸二氢钠-纯甲醇(9∶1)，流速1 mL·min-1，进样量10 μL，检测波长260 nm，柱温30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 有机溶剂的确定

室温时，5-氟尿嘧啶在不同溶剂中的溶解度见表1。

表1 5-氟尿嘧啶在不同溶剂中的溶解度

由表1可知，DMSO为溶剂时，5-氟尿嘧啶的溶解度最高。

在不改变5-氟尿嘧啶浓度的前提下，考察DMSO体积分数对5-氟尿嘧啶转化率的影响，结果见图1。

图1 DMSO体积分数对5-氟尿嘧啶转化率的影响

由图1可知，DMSO体积分数小于30%时对5-氟尿嘧啶转化率的影响很小；之后随着DMSO体积分数的增大，转化率明显下降。这是由于，低剂量DMSO对细胞或微生物的生长无明显影响[7]。因此，选择体积分数为30%的DMSO作为有机相进行后续实验。

2.2 DMSO体积比(以反应物总体积计，下同)对5-氟尿嘧啶转化率的影响

DMSO体积比对5-氟尿嘧啶溶解度提高倍数(与pH值为7.4的PBS相比)的影响见表2。DMSO体积比对5-氟尿苷产量的影响见图2。

表2 DMSO体积比对5-氟尿嘧啶溶解度提高倍数的影响

图2 DMSO体积比对5-氟尿苷产量的影响

由图2可知，随DMSO体积比的增大，5-氟尿苷产量逐渐提高；DMSO体积比为30%时，5-氟尿苷产量达到最大；随后由于高剂量的DMSO对酶活力影响较大，5-氟尿苷产量有所下降。虽然有机溶剂对转化率有一定负面影响，但在增加5-氟尿嘧啶溶解度的前提下，5-氟尿苷产量依然较高，约为单水相时的5倍。

2.3 反应温度、反应时间、装液量对5-氟尿嘧啶转化率的影响

DMSO体积比为30%，考察反应温度对5-氟尿嘧啶转化率的影响，结果见图3。

图3 反应温度对5-氟尿嘧啶转化率的影响

由图3可知，反应温度为55 ℃时，5-氟尿嘧啶的转化率达到最大。

调节两相体系pH值为7.4、反应温度为55 ℃，考察反应时间对5-氟尿嘧啶转化率的影响，结果见图4。

图4 反应时间对5-氟尿嘧啶转化率的影响

由图4可知，反应时间为1.5 h时，两相体系中5-氟尿嘧啶的转化率最高。

装液量对5-氟尿嘧啶转化率的影响见图5。

图5 装液量对5-氟尿嘧啶转化率的影响

由图5可知，装液量为3 mL/50 mL时，5-氟尿嘧啶的转化率最高。

2.4 球面对称设计优化

以反应时间、反应温度、装液量为考察因素，每个因素选取5个水平，采用球面对称设计，对5-氟尿嘧啶生物转化合成5-氟尿苷的条件进行优化，其因素与水平见表3，结果见表4。每个水平重复3次，取平均值。

表3 球面对称设计优化实验因素与水平

将实验数值进行计算机多元处理，得回归方程为：

表4 球面对称设计优化实验结果

可以看出反应时间、反应温度、装液量对5-氟尿嘧啶的转化率影响显著。以转化率(Y)为首要衡量指标，对回归方程在最大值与最小值的范围内进行偏回归求解最大值，得到最优点：X1=1 h、X2=55 ℃、X3=4 mL·(50 mL)-1，理论转化率为74.11%。

以上述选出的最优条件进行验证实验，5-氟尿嘧啶的转化率达到 75.7%，高于单因素转化实验，说明该模型较好地预测了实际的结果。

2.5 讨论

DMSO被称为万能溶剂，能溶解很多药物，具有双极性，细胞毒性低[7]，在微生物转化反应中应用较广。本实验以水/DMSO为溶剂进行转化反应，通过超声等物理方式，在增加底物溶解度的前提下，确定DMSO对酶活影响很小，并且低剂量DMSO对5-氟尿嘧啶转化率有一定的促进作用，与国外报道[3]相一致。但继续增加DMSO体积分数，由于转化率的急剧下降，5-氟尿苷的产量随之降低。这可能是由于，核苷磷酸化酶具有磷酸依赖性，当DMSO体积分数过高时，会因为磷酸盐比例的降低，不能满足核苷磷酸化酶的转化要求，因此高剂量DMSO对转化率有较大的负面影响，如能解决这个问题，5-氟尿苷的产量将进一步提高。

3 结论

通过球面对称设计优化，确定5-氟尿嘧啶生物转化合成5-氟尿苷的最佳条件如下：DMSO体积分数30%、DMSO体积比(以反应物总体积计)30%、反应温度55 ℃、pH值7.4、装液量4 mL/50 mL、反应时间1 h，此时，5-氟尿嘧啶的转化率达75.7%，5-氟尿苷的产量较单水相时提高近5倍。为5-氟尿苷的两相体系生物转化的工业化生产奠定了理论基础。

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