种子扩大培养过程对类人胶原蛋白规模化生产的影响

薛文娇，范代娣

(1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.西北大学化工学院 陕西省可降解生物医药材料重点实验室，陕西 西安 710069)

种子扩大培养过程对于发酵过程虽是一个独立的变量，却是影响发酵过程效率和经济性的关键因素之一[1]。在小规模实验室发酵过程中观测到的过程变化很多都是由于接入的种子条件有所变化造成的；在发酵放大过程中，合适的种子扩大培养过程的建立对于放大培养也至关重要[2]。据报道，接入的种子年龄及种子密度都直接影响着滞后期的长短、比生长速率、细胞得率、成孢子性及最终产品的质量，从而影响生产成本[1]。

类人胶原蛋白(Human-like collagen，HLC)是利用基因工程技术将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA，经酶切修饰并进行特定的序列重复后重组于E.coli内，经过高密度发酵生产出来的一种高分子生物蛋白，该蛋白不但维持了胶原蛋白的特性，并由于其独特的重复结构，赋予其新的特性，因此应用领域更加广阔[3]。在HLC的生产放大过程中，为了获得足够多的接种量，需要增加种子的培养阶段。鉴于中试生产罐为500 L规模，作者在此采用50 L的种子罐进行第三级种子培养，以中试规模的最终菌体浓度、目标蛋白浓度及目标蛋白产率为考核指标，考察三级种子培养过程中不同移种阶段和不同种子培养基对发酵过程的影响，以确定最优条件。

1 实验

1.1 菌种与培养基

基因工程菌E.coliBL21，卡那抗性，温度诱导；质粒pNWCP31，自行构建并保存[4]。

种子培养基采用固体LB培养基和液体LB培养基，三级种子培养基由实验确定，发酵培养基和补料培养基成分同文献[4]。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶培养

从LB平板上刮取单菌落，置于盛有50 mL种子培养基的300 mL摇瓶中，于32 ℃、200 r·min-1摇床培养10 h；然后将一级种子转接入盛有50 mL种子培养基的300 mL摇瓶中，在相同的条件下培养10 h。

1.2.2 三级种子培养

将已培养好的二级种子培养液接种到装有24 L三级种子培养基的50 L发酵罐中，控制温度在32 ℃。在三级种子培养过程中，通过调节空气流量、提高搅拌转速和罐压以控制DO在20%空气饱和度，用25%(质量分数，下同)氨水自动调节pH值为6.8。

1.2.3 分批-补料培养

将已培养好的三级种子培养液接种到装有240 L发酵培养基的500 L发酵罐中，控制温度为32 ℃、空气进气流量为600 L·min-1。在分批-补料培养阶段，通过提高搅拌转速控制DO在20%空气饱和度，用25%氨水自动调节pH值为6.8。当发酵罐中的葡萄糖耗尽时，采用近指数的补料方法控制比生长速率[5]。当OD600达到95(约45 g·L-1细胞干重)时，升温至42 ℃开始诱导，3 h后降温至39 ℃，继续诱导4～6 h。

1.2.4 移种阶段的确定

分别在细胞生长的对数期前期、中期、后期及稳定期移种，考察中试规模菌体浓度、目标蛋白浓度及目标蛋白产率，以确定最佳移种阶段。

1.2.5 三级种子培养基的确定

种子培养基的选择是获得合适的种子培养物的关键因素之一。Lincoln[6]认为，选择生产阶段的发酵培养基作种子培养基可以缩短滞后期。而使用和发酵培养基完全不同的培养基作种子培养基是非常危险的，因为两种培养基的pH值、渗透压以及阴离子差距过大可能会引起细胞吸收速率的突然改变，从而影响细胞的存活性[7]。因此，本实验除葡萄糖和酵母粉外，三级种子培养基中其它成分的浓度与发酵培养基相同。保持葡萄糖和酵母粉浓度比值不变，调节葡萄糖浓度分别为10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1，均在对数期后期移种，考察中试规模菌体浓度、目标蛋白浓度及目标蛋白产率，以确定最佳种子培养基。

1.2.6 分析方法

葡萄糖浓度：斐林试剂法[8]。

细胞密度：取10 mL发酵液，离心，弃上清液，将沉淀用重蒸水洗涤3遍后，60 ℃烘干至恒重。计算单位体积发酵液中细胞干重，即为细胞密度。

乙酸浓度：RP-HPLC法[9]。

类人胶原蛋白表达量：取10 mL发酵液，离心，弃上清液，将沉淀用重蒸水洗涤3遍后，重悬浮，超声波破碎，用羟脯氨酸测定法[10]测量破碎上清液中类人胶原蛋白含量。

2 结果与讨论

2.1 三级种子培养过程特点

将摇瓶培养的二级种子(OD600达到2.4)接种到50 L种子罐进行三级种子培养(培养基中葡萄糖浓度为20 g·L-1，其它成分同发酵培养基)，考察其培养过程特点，结果如图1所示。

图1 三级种子培养过程的特征曲线

由图1可以看出，该细胞生长过程符合一般分批培养的细胞生长动力学，即该过程基本由4个阶段组成：滞后期、对数期、稳定期与衰亡期(由于培养时间较短，衰亡期在图中表现不明显)。在对数期，细胞生长最快，比生长速率(μ)达到最大，约为0.7 h-1。在对数期与稳定期之间还存在一个减速期。乙酸浓度在减速期就开始下降，达到稳定期时其浓度已接近于0。由于减速期持续时间较短，同时其生理特征介于对数期和稳定期之间，故在后续移种阶段的考察中未考虑该阶段。

2.2 移种阶段的确定

根据三级种子培养过程的特征曲线，分别在细胞生长的对数期前期(培养时间3 h)、中期(培养时间5 h)、后期(培养时间7 h)及稳定期(培养时间10 h)移种，移种体积为发酵培养基初始体积的10%，考察移种阶段对发酵过程的影响，结果如表1所示。

由表1可知，在对数期各阶段移种，对最终的DCW及HLC浓度几乎没有影响，HLC表达量也相差不大，但是培养时间不等，并最终导致HLC平均产率不同。在对数期后期移种，HLC平均产率最高，达到0.518 g·L-1·h-1。这主要是因为在对数期后期移种，种子培养期达到的细胞密度最高，而种子活力及比生长速率与对数期前期及中期基本相同，因此接入到生产罐时，达到同样细胞密度所需的时间最短。

表1 移种阶段对发酵过程的影响

由表1还可知，在稳定期移种，HLC表达量最高，而最终HLC浓度却最低。这是因为，最终DCW(52.4 g·L-1)相比对数期移种有很大程度的降低(约降低17%)。尽管有研究表明，相比对数期接种，稳定期接种可提高质粒稳定性[11]。但本研究所使用的表达体系和发酵体系的质粒稳定性较好，因此稳定期接种与对数期接种相比，其质粒稳定性的提高并不明显，反而导致细胞活性降低、滞后期延长，最终DCW降低，进而导致最终HLC浓度及平均产率降低。

2.3 种子培养基中葡萄糖浓度的确定

培养基浓度高，得到的种子密度高，发酵过程所需的时间较短，目标蛋白产率就高；但培养基浓度过高，会导致乙酸等有害副产物浓度增加，影响移种细胞的生理状态，从而影响发酵过程及目标蛋白产率。此外，对于重组菌培养过程，其质粒稳定性对于目标蛋白产率非常重要。培养基浓度过高，可能会延长对数生长期，而细胞在高速生长时，其质粒的丢失率也较高，因而会降低目标蛋白表达量。在HLC生产过程中，培养基中葡萄糖浓度对发酵过程的影响见表2。

表2 种子培养基中葡萄糖浓度对发酵过程的影响

由表2可知，当种子培养基中葡萄糖浓度低于20 g·L-1时，所需的培养时间较长，导致HLC平均产率较低；当种子培养基中葡萄糖浓度高于20 g·L-1时，由于质粒丢失，最终HLC浓度降低，同时HLC表达量降低；特别是当种子培养基中葡萄糖浓度为40 g·L-1时，不仅最终HLC表达量降低，最终DCW也急剧降低，其原因可能是在该批次种子培养过程中，鉴于设备供氧能力，无法保持DO在20%空气饱和度，从而可能导致混合酸发酵副产物，影响种子存活力。因此，在三级种子培养过程中，其培养基中葡萄糖浓度宜选择20 g·L-1，其后发酵过程所需的培养时间较短，HLC表达量较高，HLC平均产率最高达到0.518 g·L-1·h-1。

3 结论

研究了三级种子培养过程中不同移种阶段及不同种子培养基对类人胶原蛋白发酵过程的影响。结果表明：在对数期后期移种，HLC平均产率最高；而稳定期接种，却导致细胞活性降低、滞后期延长，最终DCW、最终HLC浓度及HLC平均产率都较低。另外，当种子培养基中葡萄糖浓度为20 g·L-1时，其后发酵过程所需的培养时间较短，HLC表达量较高，HLC平均产率最高，达到0.518 g·L-1·h-1。

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