微生物发酵法生产2，3-丁二醇的研究

蒋丽群，郭 峰，方 真，龙运多，张 帆

(1.中国科学院西双版纳热带植物园 热带植物资源开放实验室生物能源组，云南 昆明 650223；2.中国科学院研究生院，北京 100049)

随着化石燃料的短缺和石油价格的增长，应用生物方法生产化学产品的生物炼制技术倍受关注[1～3]。

2，3-丁二醇(2，3-BD)是一种极具价值的液体燃料，燃烧值为27 kJ·g-1，可以与甲醇(22 kJ·g-1)、乙醇(29 kJ·g-1)相媲美[4]，在能源、食品及化工等领域应用广泛[5～7]，且在染料、增湿和柔顺剂、炸药、香水、药物载体等领域显示出潜在的应用价值[6，8，9]。因此，微生物发酵法生产2，3-BD已成为国内外研究的热点[10～14]。

作者在此以相对廉价的尿素为唯一氮源、以葡萄糖为底物，采用Plackett-Burman实验、最陡爬陂实验以及中心复合实验相结合的响应面法对产酸克雷伯氏菌发酵产2，3-BD的培养基进行了优化。

1 实验

1.1 菌种与培养基

产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)CICC 22912，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

固体培养基(g·L-1)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，NaCl 5，琼脂 20。

种子培养基(g·L-1)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，NaCl 5，初始pH值6.8～7.0。

原始发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖 100，K2HPO413.7，KH2PO43.9，(NH4)2SO46.6，(NH4)2HPO43.3，MgSO4·7H2O 0.25，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl20.01，EDTA 0.05。

上述培养基均在115 ℃下灭菌20 min(FeSO4·7H2O溶液配制完成后用孔径0.22 μm的无菌双层微孔滤膜过滤备用)。

1.2 培养方法

种子培养：将甘油管保藏的菌种转接至固体培养基，37 ℃下活化12 h。将1环活化的菌种接种于装有50 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，在转速为120 r·min-1的台式恒温摇床中，于37 ℃恒温振荡培养12 h，获得种子液。

发酵培养：将上述种子液按体积分数为5%的接种量接种于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在转速为150 r·min-1的台式恒温摇床中，于37 ℃恒温振荡培养80 h。

1.3 实验设计

运用响应面法，采用 Design-Expert 8.0.2软件进行实验设计和数据分析，主要由以下3部分组成：

(1)Plackett-Burman实验

根据微生物生长所需要的营养条件及微生物发酵的影响因子的一般规律，在单因素实验的基础上，进行Plackett-Burman实验设计，其因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman实验的因素与水平

(2)最陡爬坡实验

爬坡实验的起点为单因素实验所确定的最优点，爬坡的方向由Plackett-Burman实验的T值决定，T为正值时爬坡方向为递增，T为负值时爬坡方向为递减；爬坡的步长由T值和单因素实验结果确定。

(3)中心复合实验

根据响应面中心复合实验的设计原理，以2，3-BD得率为响应值，设计2因素5水平共13个实验点的实验，其中包括4个析因设计实验点、4个轴点设计实验点以及5个中心点重复实验实验点。

1.4 分析方法

发酵液中的葡萄糖、2，3-BD以及3-羟基丁酮均采用高效液相色谱仪(岛津CL-20A)测定。色谱柱为Aminex HPX-87H型离子色谱柱(300 mm×7.8 mm，Bio-Rad)，柱温为60 ℃，流动相为0.005 mol·L-1H2SO4，流速为0.6 mL·min-1，检测器为RID-10A。按下式计算2，3-BD得率(Y)：

式中：m1、m2、m3分别为2，3-BD、3-羟基丁酮、消耗的葡萄糖的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman实验

以2，3-BD得率为响应值，每次实验重复3次，取平均值。Plackett-Burman实验结果见表2，显著性分析见表3。

表2 Plackett-Burman实验结果

表3 Plackett-Burman实验的显著性分析

由表3可知，X2和X7的P值小于0.05，这表明，尿素和乙酸对2，3-BD得率影响显著，可通过最陡爬坡实验和中心复合实验进一步优化。而其它不显著影响因素，根据系数或T值的正负确定该因素为表1中的高或低水平，不再进一步优化。如葡萄糖的T值为负，则选其低水平，即80 g·L-1。

2.2 最陡爬坡实验

以单因素实验确定的最佳水平(即尿素浓度为4.50 g·L-1、乙酸浓度为0.50 g·L-1)为起点，分别以0.30和0.10为步长，进行最陡爬坡实验，结果见表4。

表4 最陡爬坡实验结果

由表4可知，当尿素浓度为5.10 g·L-1、乙酸浓度为0.70 g·L-1时，2，3-BD得率最大。

2.3 中心复合实验

中心复合实验结果、回归方程系数显著性检验分析分别见表5和表6。

表5 中心复合实验结果

表6 回归方程系数显著性检验

由表6得到拟合的多元二次方程为：

由Design-Expert 8.0.2绘制的响应面曲线图及等高线图见图1。

由图1a可知，响应值存在最大值。经软件分析预测，当尿素=0.1(即5.13 g·L-1)、乙酸=0.03(即0.703 g·L-1)时，预测的2，3-BD最大得率为0.456 g·g-1。即最佳的发酵条件是：葡萄糖80 g·L-1，尿素5.13 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，EDTA 0.05 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05 g·L-1，乙酸 0.703 g·L-1，K2HPO412.55 g·L-1，KH2PO43.9 g·L-1。此时，2，3-BD的得率达到0.456 g·g-1，较初始条件提高了23.2%，达到了理论得率的91.2%。

图1 响应面图(a)及等高线图(b)

为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵培养条件下进行3组平行实验，得到2，3-BD得率的平均值为0.454 g·g-1，与回归方程的预测值基本一致。

由图1b可知，等高线图呈圆形，表明尿素和乙酸的交互作用不显著。

3 结论

采用Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验以及中心复合实验相结合的响应面法对产酸克雷伯氏菌产2，3-丁二醇的培养基进行了优化。结果表明：

(1)相比于酵母粉、蛋白胨或铵盐等氮源，本实验采用较为廉价的尿素为唯一氮源，获得了较高的2，3-丁二醇得率，具有经济性和工业化发展潜力。(2)应用Plackett-Burman实验对影响发酵的因子进行评价，结果发现尿素和乙酸的浓度对2，3-丁二醇得率具有显著影响。(3)通过中心复合实验，建立了发酵产2，3-丁二醇的数学模型，经分析得到尿素和乙酸的最佳组合为：尿素浓度5.13 g·L-1、乙酸浓度0.703 g·L-1。(4)在最佳发酵条件下，2，3-丁二醇得率达到0.456 g·g-1，相对于原始的发酵条件，得率提高了23.2%，达到了理论得率的91.2%。

该研究对进一步以富含葡萄糖的木质纤维素水解液为发酵底物产2，3-丁二醇的研究具有一定的指导意义，为木质纤维素资源的开发利用奠定了良好的基础。

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