中国大鲵5个野生种群的AFLP分析*

杨丽萍，蒙子宁，刘晓春，张 勇，黄俊海，黄 景，林浩然, 4

(1.中山大学水生经济动物研究所∥广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东 广州 510275；2. 西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；3. 珠海金鲵野生动物养殖有限公司，广东 珠海 519015；4. 海南大学海洋学院, 海南 海口 570228)

中国大鲵Andriasdavidianus隶属于两栖纲Amphibia，有尾目Caudata，隐鳃鲵科Cryptobrachidae，大鲵属Andrias，是中国特有的珍稀濒危物种，广泛分布于长江、黄河及珠江中下游支流中，遍及华中、华南和西南等17个省区[5]。中国大鲵具有终身水栖的生理特性，因而难以越过陆地迁徙，其遗传分化很可能与流域分布相关联。然而，近期报道却显示二者之间关联性不强[6-8]。这些研究主要使用了线粒体编码基因序列和同工酶方法，所分析的样品总数在13-28尾。样品数目偏少很可能无法反应物种真实的遗传结构，因此有必要采用新方法，扩大样品量进一步进行中国大鲵遗传分化与系统地理学的研究。

新型分子标记AFLP，融合了RFLP的可重复性和RAPD的简便性，具有信息量大、灵敏度高、多态性丰富和重复性好等优点[9]。早期AFLP分析主要应用于植物领域[10]，随后逐步拓展到动物领域，目前已广泛应用于黑真螈Salamandraatra、日本大鲵A.japonicus和草莓箭毒蛙Dendrobatespumilio等两栖类遗传结构分析及保护遗传学研究[11-13]。

本研究拟利用AFLP技术进一步分析中国大鲵五个地理种群遗传多样性和遗传分化，并联系相关历史地理事件，对中国大鲵种群的遗传结构特点及其历史成因进行探讨，旨在获得中国大鲵种群的遗传多样性资料，以及遗传分化与环境间的相互关系，为合理利用大鲵种质资源提供遗传背景资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料及DNA提取

中国大鲵各地理种群样品由珠海斗门金鲵水产科技有限公司在各原产地获得，采样地及所属流域见表1和图1，包括5个种群共60个个体。剪取尾部少量肌肉组织，置于液氮保存，运回实验室后放入-80 ℃超低温冰柜备用。

取出保存备用的大鲵肌肉样品，剪取约50 mg组织，采用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。w=0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，Eppendorf分光光度计测定DNA纯度与浓度。

1.2 AFLP扩增及数据分析

AFLP扩增参照Vos等[14]所报道的方法并做略微改动。基因组DNA用EcoRI和MseI 37 ℃双酶切10 h，加入接头混合物后于22 ℃过夜。用带有1个选择性碱基的引物(E-A，M-C)进行预扩增。少量预扩增产物用于电泳检测，剩余样品经灭菌水稀释10倍后作为选择性扩增模板。使用带有3个选择性碱基的引物进行选择性扩増。扩增产物经w=4.5% 变性聚丙稀酰胺凝胶分离后，通过银染法显带。以扩增条带数目适中、分布均一和多态性高为标准，从96对引物组合中筛选出9对引物组合(E-AAC/M-CGT、E-ACA/M-CAC、E-ACT/M-CGA、E-ATC/M-CGA、E-ATC/M-CTT、E-ATG/M-CGT、E-ATG/M-CGA、E-ACA/M-CGA和E-AGA/M-CGA)用于本研究。AFLP操作流程中所用药品均购自上海生工生物工程技术服务有限公司(Shanghai Sangon)，PCR仪为PTC-200扩增仪(Bio-RAD)。

1.3 数据分析

电泳图谱中的每条DNA谱带记为一个位点，只记录电泳后可辨认的条带。当某一扩增带出现时记为1，缺失记为0，从而建立原始谱带矩阵。

利用种群遗传学软件POPGENE1.32对“1/0” 矩阵进行处理，统计多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数，评估中国大鲵五个地理种群的遗传多样性水平。

通过WINAMOVA v 1.55软件，依据AMOVA(analysis of molecular variance)方法计算居群内和居群间的遗传变异、Fst类似物Phist(Фst)和遗传距离。通过MEGA 3.1软件对种群间遗传距离构建UPGMA系统进化树。

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表1 采样点及样本信息

图1 中国大鲵种群样品的采样地(黑色圆点表示)

2 结 果

2.1 遗传多样性

9对引物在中国大鲵5个种群60个样品中共检测到507个位点，其中多态位点数为354个，多态位点比例为69.82%，片段大小在100～1 300 bp之间。图2列举了E-ATG/M-CGA引物组合对各地理种群进行AFLP扩增的电泳图结果。中国大鲵5个种群总的多态位点比例、香农信息指数和基因多样性指数分别为69.82%，0.362 9和0.241 4。其中5个地理种群的多态位点比例呈贵州>陕西>河南>四川>湖北的递减(见表2)。贵州种群的香农信息指数和基因多样性指数最高，分别为0.281 1±0.013 8和0.194 6±0.009 7；湖北种群的香农信息指数(0.226 6±0.013 3)和基因多样性指数(0.156 3±0.009 3)最低，其变化趋势与多态位点比例相同(见表2)。

图2 引物组合E-ATG/M-CGA对中国大鲵5个种群AFLP扩增的部分带谱

表2 中国大鲵5个野生种群多态位点比例、香农信息指数和基因多样性指数

Table 2 Percent of polymorphic loci, Shannon information index and gene diversity within five nature populations ofA.davidianus

种群多态位点比例香农信息指数基因多样性指数河南 41.22%0.243 8±0.013 50.168 2±0.009 5四川40.63%0.245 7±0.013 50.170 0±0.009 5陕西 44.38%0.261 4±0.013 60.180 1±0.009 5湖北 37.67%0.226 6±0.013 30.156 3±0.009 3贵州 46.94%0.281 1±0.013 80.194 6±0.009 7总计 69.82%0.362 90.241 4

2.2 遗传分化与遗传距离

通过AMOVA方法对各种群遗传变异进行了分析，结果显示，有97.94%的变异存在于种群内，仅有2.06%的变异存在于种群间。AMOVA分析得到遗传分化参数Фst 为 0.021(P<0.001)，显示种群间遗传分化较小。

种群间的遗传距离分布于0.004 6～0.040 8(表3)。其中，贵州与四川种群之间遗传距离最小，为0.004 6，而湖北与河南种群之间遗传距离最大，达到0.040 8。

采用种群间遗传距离构建了UPGMA树(见图3)。系统树主要分为两大支，一支由黄河流域河南种群组成；另一支由长江流域四川、贵州、湖北和陕西种群组成，其中属于长江中游段重要支流汉江水系的陕西和湖北两个种群聚类，属于长江上游段的四川种群和贵州种群聚类。基本依照流域进行聚类。系统进化树中最早分出的是位于中国北部的河南种群；地处中国中部的湖北和陕西种群先于位于南部的贵州和四川种群分出。进化地位的古老性关系体现为北部>中部>南部。

表3 中国大鲵5个野生种群间遗传距离

图3 基于种群间遗传距离构建的UPGMA树

3 讨 论

3.1 中国大鲵野生种群遗传多样性分析

从进化观点来看，中国大鲵是由3亿6千万年前古生代泥盆纪时期水生鱼类演变而成的古老两栖动物，对探讨脊椎动物由水生到陆生的演变具有关键性的意义。为阐明中国大鲵的遗传背景，本研究将中国大鲵与其近缘物种以及进化历程相近的物种进行了遗传多样性的比较。

本研究AFLP分析得到的中国大鲵种群多态位点比例(P)为69.82%，基因多样性指数(H)为0.241 4。中国大鲵的遗传多样性高于施氏巴鲵Liuashihi(H：0.154 0)[16]，但低于俄勒冈陆巨螈(H：0.309 4)和赤背蝾螈(H：0.246 0)[3-4]。上述两种鲵类基因多样性低于两种蝾螈类相应遗传参数，从栖息生境来看，所比较的两种鲵类为终身水栖，而两种蝾螈类均为成体陆栖。Nevo等[17]在对两栖类进行等位酶分析时发现，陆栖生物相比水栖生物具有更高的遗传多样性，这与陆栖生物具有相对较广的生境宽度(niche breadth)和更高的生态稳定性(ecological stability)等有关。此外，将中国大鲵与其进化历程相近的一些古老物种进行比较，中国大鲵的遗传多样性均高于所比较的巴西蛇颈龟Hydromedusamaximiliani(P：37.00%)[18]、北美食鼠蛇Elapheobsoleta(P：35.00%)和扬子鳄Alligatorsinensis(P：58.50%)[19-20]。遗传多样性参数均揭示中国大鲵遗传多样性较为丰富，这与其生活史特征及地理分布相一致。中国大鲵一般3～5龄性成熟，生活史长达100多年，较大的年龄结构差异容易维持较高的遗传多样性水平[21]。此外，中国大鲵分布区域遍及中国17个省区，在暖温带、亚热带不同气候条件下均有分布。分布区域较广也是其遗传多样性较高的一个原因。遗传多样性是物种长期进化的产物，与物种适应能力、生存能力和进化潜力密切相关。由此可见中国大鲵这一古老物种能够历经几亿年自然环境和气候的变化存活至今，与其具有较高的遗传多样性有一定的关系。

中国大鲵5个地理种群的多态位点比例由高到低依次为贵州(46.94%)>陕西(44.38%)>河南(41.22%)>四川(40.63%)>湖北(37.67%)。大鲵在上述5个取样地均呈现集中分布。陕西省太白县湑水河设立有国家级中国大鲵自然保护区，地理位置处于汉江上游，位于陕西汉中之上。贵州龙里所处的乌江水系上游也设有中国大鲵自然保护区。河南卢氏县建有省级中国大鲵自然保护区。贵州、陕西和河南种群遗传多样性相对较高，可能与自然保护区对中国大鲵野生种群的保护效果较好有关。

大鲵的人工养殖于20世纪70年代开始在各地广泛开展。养殖基地亲本多来自野生种群，养殖业的蓬勃发展，可能会影响到野生种群遗传结构。湖北省十堰市房县建有驯养规模在万尾以上的中国大鲵养殖基地，为建立亲本群体，当地野生种群可能经历过一次瓶颈效应，造成遗传多样性水平较低。而在同样建有大规模养殖基地的陕西省汉中，中国大鲵遗传多样性仍然维持在较高水平，这可能与当地野生种群遗传多样性自身水平较高有关。

3.2 遗传结构及种群分化

中国三大水系的发育形成具有上亿年的历史，其中长江与“黄河”分隔较早，在中生代侏罗纪末至白垩纪初，秦岭山脉的上升，切断长江与北方的联系，经历燕山运动后期后，长江全貌显现[22]。长江与珠江的分离是在白垩纪末、第三纪初燕山运动之南岭期时成形[23]。黄河的形成时期最晚，在新生代第四纪，由于喜马拉雅运动，西部青藏高原地势升高，原有的湖泊相连而成。尽管黄河形成比较晚，但早期已经出现大量湖泊溪流[24]。迁徙力较差的古老物种在经历地理分隔事件后，物种群体间基因流被阻断，随着时间的积累而产生种内差异，地理格局往往可以反映其遗传关系。本研究中国大鲵种群的聚类情况大致依照所属流域进行，体现了与地理分布格局的统一性。种群聚类分析显示中国大鲵依照长江流域和黄河流域分为两大支。其中长江流域中属于长江中游段重要支流汉江水系的陕西和湖北两个种群聚类，属于长江上游段的四川种群和贵州种群聚类。然而来自线粒体与同工酶方法的结果却未得到聚类与流域一致[6-8]。Murphy等[6]采用线粒体与同工酶技术分析中国大鲵遗传多样性所用样品量为18尾，陶峰勇等[7-8]利用Cyt b和控制区序列分析时分别用到13尾和28尾。而本研究样品量达到60尾。样品量多少可能会影响到种群间遗传距离与聚类分析。此外，分析方法的差异可能会影响到结果，同工酶方法检测的多态位点数目有限，相比而言AFLP标记可获得丰富的多态位点。

AFLP分析得到的遗传分化指数Фst仅为0.021，显示分化较低。种群间AMOVA遗传变异分析也显示，在众多变异中有97.94%存在于种群内，仅有2.06%变异存在于种群间。遗传距离结果也显示中国大鲵不同地理种群间遗传差异较小。中国大鲵自身迁徙力很差，除在自身流域内活动外，在各流域之间迁徙较难，那么为什么中国大鲵种群间的遗传分化如此小呢？分析中国大鲵的使用历史，可以得出人为操作是主要诱因。对中国大鲵食用与药用价值的认识最早始于战国时期，距今有近2 300 a历史，在相互交流中可能有中国大鲵的移动发生。但由于古代交通闭塞，这种人为影响作用相对较弱。在20世纪50年代到80年代，人们对中国大鲵进行了大规模捕杀贩卖，其中存在个别个体在非原产地逃逸的现象；另外，对于被查获而没收的中国大鲵活体，国家相关管理部门通常采用就近放流，此操作直接将其它地理种群引入当地野生群体，造成极强的基因流效应。此外，人工放流也是降低种群分化的一个重要原因。人工养殖鲵苗的亲本往往来自于全国各主要产区的野生个体，放流操作一方面使得野外群体数量短期得到大量增加，另一方面也严重破坏了当地原有种群的遗传结构。在2002-2009年期间，中国大鲵各原产地先后组织了多次大规模的人工放流。

依据种群间遗传距离构建的UPGMA树得出位于中国北部的黄河流域群体处于树的基部，显示北部群体具有较为古老的进化地位。其次分出的是位于中部的湖北、陕西种群，最后为南部贵州及四川种群。提示中国大鲵北部种群更为原始，其次为中部和南部种群。基于此推测，中国大鲵首先到达中国北部，并由此进一步向中部及南部地区进行扩散(图4)，即由河南→陕西、湖北→四川、贵州。这一推测得到了化石证据的进一步支持。最早的现生蝾螈类化石发现于中国内蒙古及河北地区，地质年代为侏罗纪中期，其骨骼结构以及形态发育与隐鳃鲵科相似性极高[25-26]。黄河流域是离中国内蒙古及河北地区最近的区域，因而应该是中国大鲵最先到达的地域，进而由此扩散到中南部地区。

图4 推测中国大鲵扩散途径示意图

中国大陆黑斑侧褶蛙的扩散途径与本研究得出的中国大鲵的扩散途径一致，即由北向南进行扩散[27]，而杨玉慧等对中国黑斑蛙分析得出了由南至北的扩散方式[28]。历史上冰期与间冰期旋回引起的气候波动及生境变化会影响到物种分布与扩散。第四纪冰期对北美洲和欧洲影响较大，当地冰期后物种普遍呈现由南向北的扩散模式[29-30]。东亚由于受到青藏高原隆起及季风气候的影响，冰川发育程度和面积要比北美与欧洲弱。在冰期影响不严重的地域，不同物种由于自身生境条件、繁殖能力与扩散能力的不同，其扩散途径可能存在差异。

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