活体小鼠脑组织Ca2+敏感荧光染料双光子成像的观察*

彭诗宇，任振华,徐金勇,顾怀宇,李光武,

(1.安徽医科大学神经生物学研究所，安徽 合肥230032；2. 安徽医科大学人体解剖学教研室，安徽 合肥 230032；3.中山大学中山医学院人体解剖学教研室，广东 广州 510080)

现代神经生物学的一大挑战就是如何对活体动物大脑进行有效的成像观察与记录。长期以来，对动物脑组织结构的观察多数停留在形态学染色的层面上，这类方法虽然有效，但对于活动脑组织的观察却无能为力[1]。也有许多有效观测活体动物脑组织的方法，如细胞内和细胞外的电生理记录，功能性核磁共振(Functional Magnetic Resonance Image,FMRI)[2]，正电子发射计算机扫描(Position Emission Tomography,PET)等，但这些方法普遍脑损伤偏大或时间空间分辨率偏低的缺点。近年来发展起来的双光子激光共聚焦显微镜(Two-photon Laser Scanning Microscope，TPLSM)在一定程度上有效地克服了上述缺点，成为脑成像研究的重要工具。

双光子激光共聚焦显微镜结合了激光共聚焦显微镜技术和双光子激发技术[3]。其中双光子激发技术是基于当荧光基团吸收相同两个长波长光子照射后，经过极短的一段时间，会发射出一个短波长的光子，效果和单纯吸收一个波长为长波长一半的短波长的光子对其的激发效果完全一样的原理[4-5]。在这个过程中涉及到的物理背景复杂，并不能理解为单纯将某个光子的波长扩大一倍就成为长波长光子，所以说双光子技术的出现提供了新的，可供选择的成像方法[6]。相较于目前一些使用清醒动物作为模型采取双光子进行成像的实验方法，本实验中采取的方法相对保守，对麻醉后的活体动物的脑组织注射Ca2+敏感荧光染料而后进行双光子观察和记录。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与试剂 昆明小鼠数只，年龄在20～30 d(购自安徽医科大学实验动物中心)；低融点琼脂糖(Amresco公司)；人工脑脊液(ACSF，自配)；乌拉坦(150 mg/mL)；SPS缓冲液(150 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L KCl和10 mmol/L HEPES)；0.2的F-127溶于二甲亚砜(Sigma公司)； Sulforhodamine 101(SR101，Sigma公司)；具有膜渗透性的钙指示剂(Oregon Green 488 BAPTA-1-AM，Invitrogen公司)

1.1.2 实验仪器和设备 手术器械(包括剪刀，细口镊，棉签，吸耳球，一次性吸液管)；CMA/450 动物恒温控制器；小鼠脑立体定位仪或固定器(淮北正华精密仪器有限公司)；牙科用吊磨机及微钻头；玻璃注射电极；显微操作仪(可注射)(如SUTTER公司 MP-85型)；双光子激光共聚焦显微镜(Olympus FV 1000MPE，中国科学院生物物理研究所公共开放平台提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 麻醉动物 用150 mg/mL的乌拉坦对小鼠进行腹腔注射(按照每10 g 体质量0.1 mL的剂量)麻醉，将麻醉后的小鼠水平放置在保温板上并用脑立体定位仪进行固定，调节温度使其恒定在37 ℃。

1.2.2 定位 使用鼠脑脑立体定位仪并参照小鼠脑定位图谱对要观测的脑区进行定位[7]，以确定开颅位置(也可在开颅后按脑血管位置进行定位，本实验中即采用这种方法)。在待开颅区域皮下注射50 mg/mL的乌拉坦进行局部麻醉。

1.2.3 开颅前准备 用剃须刀剃去小鼠待观测区域头皮上的毛发，剪去头皮，剔除覆盖在头骨上的筋膜，暴露头骨，在开颅前保持待头骨的湿润(可用棉签蘸取ACSF)。

1.2.4 开颅 用电钻小心按圆形轮廓打磨待观察区域头骨。待头骨边缘呈半透明状态后轻轻按压头骨，观察到其边缘软化即可停止，用尖端极细的镊子小心从边缘夹取头骨边缘将其轻轻剥离开来[8]。在这个过程中，务必要保持操作上的准确无误，避免流血，很小的震荡都会引起脑组织的损伤，从而影响成像。

1.2.5 配制及注射染料 将Oregon Green 488 BAPTA-1 AM溶解于F-127中，使其浓度保持在10 mmol/L。然后按0.4 μL(OG-1 AM)，0.5 μL(SR101)和4 μL(SPS)配成染料。使用玻璃电极配合微操作臂以45°角将染料按不同深度(100～400 μm)注射进入脑组织，每次给药量在0.05～0.1 μL之间，采用多点注射，使染料在脑组织中连成片，在选取注射点时要尽量避开血管，缓慢注射，一般2～3 min/次。注射完成后用一次性滴液管制作塑料小帽并用牙科水泥粘附头骨上，暴露待观察位置。在脑组织外滴加低熔点琼脂糖覆盖，防止其干燥。1 h后待染色完成后放置在双光子激光共聚焦显微镜下进行观测。

1.2.6 双光子观测 为便于成像，需要选择合适的激发波长。在本实验中染料对应的激发波长是809 nm,激光强度至少要达到50～70 mW，但不能过高，否则会加速荧光的淬灭[3]。样本观察观察深度为100～400 μm。观察前首先要在荧光下确定观察区域，在40倍荧光镜下，染色的区域和周围的血管应该清晰可见，激光照射下，可清楚看到神经胶质细胞和普通神经元细胞，在此种情况下，可观察并测量单个或一群神经元细胞内Ca2+水平的变化，从而反映动作电位水平的变化。

1.3 图像记录和处理

保存扫描得到的图像和数据，将数据导入Origin8.0进行归一化处理。

结果见图1、图2、图3。

图1 位于小鼠感觉运动皮层下200～300 μm的神经元(黑色箭头标示)

图2 位于小鼠感觉运动皮层下150 μm的神经胶质细胞(白色箭头标示)

2 讨 论

多数活体动物的脑部成像与记录的方法，往往存在难度大，易损伤，低分辨率和观察时间短的问题[9]。双光子激光共聚焦显微镜的应用很好的解决了上述问题，由于神经元内的Ca2+水平变化和电位变化密切相关，故本实验采用结合Ca2+敏感染料对小鼠脑部结构进行双光子成像的观察。试验结果较好，既能够得到相对高分辨率的图像，又可以通过Ca2+敏感染料的特性记录到神经元快速发放的电活动。在实验中要尽量避免待观察脑区部位出现大量出血现象，过量流血会影响神经细胞的活性近而影响成像效果[10]，在记录神经元的Ca2+信号时，还要注意减少样本整体的机械振动，如在活体成像时，活体动物的呼吸和心跳往往是较大的干扰源，所以，控制好机械振动，也是获得稳定实验结果的重要因素。另外，本实验选择了与乙酰羟甲基酯(acetoxymethyl,AM)相结合的染料来给神经元进行染色，乙酰羟甲基酯易于通过质膜进入细胞，在进入细胞后即被非特异性酯酶水解，留在细胞内的荧光探针与细胞内的靶结构或靶分子结合发挥作用[11]。

同传统激光共聚焦成像的方法相比，双光子成像具有许多优点：① 长波长激发光的透射性更强，能更少地减少焦平面以外的荧光分子的激发，故能扫描到样本平面以下更深的区域[12]。② 长波长激光有近红外光的特性，在造成光毒性方面较紫外光和可见光要小很多。③ 更低的光漂白率：双光子显微镜的光源由于散射性比较小，所以只在观察的焦平面上才有光漂白和光毒性[13]，所以利用双光子显微镜可以对样本进行长时间的观察。双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察比较厚的样本和活细胞活，或进行定点光漂白实验。上述优点为观察大面积深部脑组织形态的可能性提供了理论依据。

双光子激光共聚焦显微镜的另一个的另一个显著优点就是：在图像的时间和空间分辨率均有明显的提高，由于能集中在小物体上进行激发光的散射，所以在较小物体的成像中这种分辨率的提高尤为明显，可以利用它来进行各种细胞水平上的在体和体外的成像，尤其是可以对活体动物进行神经动力学和形态学观察，如Ca2+信号变化的观察和电生理的观察。运用这些方法得到的对神经系统的快速变化和高分辨率的图像是过去的技术所不及的。目前，本研究所正专注于对嗅觉系统与嗅觉系统对脑内投射[14]的高级功能的研究，双光子显微镜技术以及其在活体成像记录上的优点为研究复杂嗅觉系统的结构功能提供了一种新的途径。

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