交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析重组蛋白二硫键分布的方法建立*

徐祖敏，程 锐，杨 霞，杨中汉，刘少军，黎明涛，蔡卫斌，高国全

(1. 中山大学中山医学院生化教研室，广东 广州 510080；2.中山医学院蛋白质组学实验室，广东 广州 510080)

二硫键是肽链内或肽链间两个半胱氨酸的巯基氧化而成的共价键，主要参与维持蛋白质分子的天然构象、保持及调节蛋白质的生物活性与稳定性[1]。目前常用的蛋白质二硫键定位方法主要包括X射线衍射晶体结构解析法、多维核磁共振波谱法(NMR)、对角线法、二硫键异构及突变分析法和酶解法等。X射线晶体衍射法是确定蛋白质构象最准确的方法，但依赖于纯蛋白高度有序结晶的形成。NMR的特点是在近似自然生理条件的溶液状态下测出较小蛋白质的构象。上述两种方法进行二硫键研究时的缺点在于：要求样品量比较大，一些柔性的蛋白质不易得到所需的晶体，并且结构复杂、相对分子质量较大的蛋白的计算处理和解谱非常复杂。而对角线法、二硫键异构及突变分析法和酶解法等，则存在操作繁琐，分析复杂等缺点，应用受到限制[2]。随着质谱仪器在分辨率、灵敏度、准确度和检测速度等方面的发展和提高，质谱法更加适合用于蛋白质和多肽结构与功能的研究，并应用于二硫键的定位分析。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF/MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，具有灵敏度高、准确度高、分辨率高且简单高效的特点，为生命科学、医学等领域提供了强有力的分析测试手段。MALDI-TOF/MS是依据样品的质荷比(m/z)的不同来进行检测，并测得样品分子的相对分子质量。相对分子质量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF/MS测定蛋白质相对分子质量准确度高达0.1%～0.01%，远远高于目前常规应用的SDS-PAGE电泳与高效凝胶色谱技术。理论上，MALDI-TOF/MS技术如能准确测定出非还原状态二硫键连接肽段和还原状态肽段的相对分子质量，进行肽段相对分子质量匹配分析，应能确定蛋白质中二硫键的分布信息。

本研究以Kringle环作为分子模型，以MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切为技术手段，探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法。Kringle环是存在于多种蛋白质分子内的结构模体，如纤溶酶原激活因子、凝血酶原、纤溶酶原、载脂蛋白a及肝细胞生长因子等[3]。Kringle环由80个氨基酸残基组成，包含6个半胱氨酸，并按照1-6，2-4，3-5的方式形成3个二硫键，从而维持独特的联环状Kringle结构。研究者采用原核表达系统表达出含单个Kringle环的重组人纤溶酶原K5多肽(rhK5)[4-5]，并分析该多肽的血管内皮细胞抑制活性[6-7]，为明确重组K5多肽中二硫键的形成以及6个Cys能否正确配对连接，进一步采用了高度特异性的质谱分析级胰蛋白酶(Trypsin Gold,Mass Spectrometry Grade)和蛋白内切酶Asp-N(Endoproteinase Asp-N)交叉酶切的方式，获取重组K5多肽理论上包含单个二硫键的特定肽段，并用MALDI-TOF/MS分别测定和配对酶切片段相对分子质量和还原后片段的相对分子质量，判断酶切片段中是否存在二硫键。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备

pET22b(+)质粒、E.coliBL21 (DE3)表达菌株和Ni2+His Bind Resin为Novagen公司产品；EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ购自Takara公司；IPTG为鼎国公司产品；His-tag鼠源性单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自Vector公司；质谱分析级Trypsin Gold购自Promega公司；Endoproteinase Asp-N购自Roche Diagnostic公司；三羟甲基氨基甲烷、盐酸、醋酸、磷酸三氯乙酯等为广州化学试剂厂分析纯；乙腈、三氟醋酸、α-氰-4-羟基肉桂酸等为Sigma公司产品；ZipTip微量固相萃取吸嘴购自Millipore公司；凝胶成像系统为GENE GENIUS公司产品，真空冻干机为Virtis公司产品，MALDI-TOF/MS质谱仪为Amersham Biosciences公司产品，JASCO-J-810圆二色谱仪为日本分光公司产品。

1.2 rhK5的表达纯化

以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原Kringle 5基因，在EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ处将其克隆进表达载体pET22b(+)中，DNA测序鉴定其连接正确； pET22b(+)/K5转化入表达宿主菌E.coliBL21 (DE3)中。IPTG 25 ℃诱导蛋白表达12h，表达产物经固化Ni2+His Bind Resin亲和层析纯化，所得重组蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot方法分析鉴定，I抗为抗His-tag鼠源性单克隆抗体，II抗为辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG。

1.3 rhK5蛋白对视网膜微血管内皮细胞的抑制活性

人视网膜微血管内皮细胞培养及鉴定参照本研究组前期研究报道[9]，活体眼组织来源于中山大学中山眼科中心。取对数生长期的细胞以1×105/mL接种到24孔培养板，培养至约80%细胞融合度时用rhK5处理，各组终浓度分别为5、10、20、40、80 nmol/L，阴性对照组为等量无血清培养液，继续培养72 h后终止处理。细胞的增殖状态采用噻唑兰颜色反应法(MTT法)检测[9]。每组设4个复孔，相同实验重复3次，计算细胞增殖抑制率(%=100-OD处理组/OD阴性对照组×100%)，作为判断rhK是否对内皮细胞增殖具有抑制活性的指标。

1.4 rhK5一级结构与二硫键分布的生物信息学分析

野生型人纤溶酶原K5的氨基酸序列从数据库http://genome.ucsc.edu/中查找pET22b(+)/BL21(DE3)原核系统表达的rhK5蛋白N-末端包含信号肽残余氨基酸序列，C-端会保留载体的部分序列及6×His标签。rhK5一级结构正确与否主要通过相对分子质量分析来验证：采用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3(Institute of Biology and Chemistry of Proteins，France)依据推测氨基酸序列计算其理论相对分子质量；采用MALDI-TOF/MS精确测定其实际相对分子质量。根据实际相对分子质量和理论相对分子质量之间的差异判断重组蛋白推测氨基酸序列是否正确(MALDI-TOF的准确度极高，一般认为蛋白质的理论相对分子质量MALDI-TOF-MS测定值之间差异不超过0.1%～0.01%)。

采用3D-JIGSAW蛋白质结构数据库(Cancer Research UK London Research Institute,UK,http://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw/)对rhK5二硫键分布进行生物信息学分析。3D-JIGSAW是以已知结构域的类比为基础预测蛋白质三级结构的服务器，特别适合于序列长度适中、序列复杂程度不高且没有四级结构的蛋白质三级结构的预测。rhK5预测结果用RasTop软件分析，获得其三级结构示意图和二硫键的空间位置分布，初步分析rhK5二硫键和Kringle结构域的形成情况。

1.5 rhK5的单酶切和交叉酶切

单酶切：将纯化的rhK5蛋白用真空冻干机制成蛋白冻干粉，后用500 μL酶切缓冲液(50 mM Tris-Cl,1 mmol/L CaCl2，pH 7.6)溶解，Bradford法测定蛋白质浓度，取100 μL蛋白溶液，加入一定量Trypsin Gold(质量比1∶50)，37 ℃水浴16 h。交叉酶切：在Trypsin Gold单酶切后的混合物中加入一定量的Endoproteinase Asp-N(质量比1:20),37 ℃水浴8 h。单酶切或双酶切完成后，将酶切后的混合物分成两等分，一份备用，另一份加入约3 μL磷酸三氯乙酯，60 ℃水浴约10 min。将此混合溶液(包括非还原状态和还原状态的蛋白质)经真空冷冻干燥制成蛋白冻干粉，并经ZipTip pipette脱盐浓缩后，与基质(α-氰-4-羟基肉桂酸)1:1均匀混合，混合物直接用于MALDI-TOF/MS分析。

1.6 rhK5空间结构的圆二色谱分析

取上述亲和层析方法纯化的rhK5蛋白用25 mmol/L 硼酸溶液(pH 7.4)透析8 h后，于JASCO-J-810圆二色谱仪在25 ℃恒温下测量其CD谱(185～260 nm)，重复测量3次，取平均值进行统计。用25 mmol/L 硼酸溶液(pH7.4)作为空白对照，偏振值扫描时蛋白的质量浓度为0.5 mg/mL。

2 结 果

2.1 rhK5的表达纯化及初步鉴定

IPTG 25 ℃低温诱导BL21(DE3)/pET22b(+)/K5重组菌表达，细菌裂解物经SDS-PAGE电泳分离并用考马斯亮兰染色分析显示(图1a)：IPTG诱导后细菌裂解产物在13 000处有明显蛋白表达。将上述蛋白提取液与Ni2+-His Bind Resin在4 ℃搅拌混合后，通过亲和层析纯化含有6个His-tag的重组蛋白，可获得高纯度可溶性蛋白rhK5。用凝胶成像系统对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达95%。重组蛋白用抗His-tag抗体进行蛋白质免疫印迹分析，显示有明显的免疫杂交带(图1b)。

图1 重组人纤溶酶原kringle 5蛋白的表达、纯化及鉴定

2.2 rhK5抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖

图2结果显示，与对照组(rhK5浓度为0 nmol/L，即未加rhK5组)相比，rhK5能明显抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖，在浓度为20 nmol/L时即有抑制作用(P<0.05)，当浓度达40 nmol/L时，差异具有显著意义(P<0.01)。这种对人视网膜微血管内皮细胞增殖的抑制作用随着rhK5浓度的增大而增加，存在明显的浓度依赖关系。

图2 重组人纤溶酶原kringle 5蛋白抑制人视网膜微血管内皮细胞的增殖

2.3 rhK5一级结构验证

根据pET22b(+)载体结构特点和目的基因插入位点分析，rhK5蛋白的N-末端包含信号肽残余氨基酸序列(NH2-MDIGINSDPNS-COOH)，C-端会保留载体的部分序列及6×His标签(NH2-KlAAALEHHHHHH-COOH)。推测rhK5一级结构(氨基酸序列)如图3A所示，并依据此序列采用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3计算出rhK5蛋白相对分子质量分别为12 834.08。SDS-PAGE电泳图谱显示(图1)，与蛋白质标准相比，区带位置与理论计算值一致。进一步采用MALDI-TOF/MS精确测定rhK5蛋白相对分子质量分别为12 826.70(见图3B)。SDS-PAGE和MALDI-TOF/MS相对分子质量分析数据证实预测的K5及其突变体重组蛋白质一级结构(氨基酸序列)是正确的。

图3 重组人纤溶酶原kringle 5蛋白的氨基酸序列示意图及其相对分子质量测定

2.4 rhK5空间结构的生物信息学分析

登录3D-JIGSAW蛋白质结构数据库http://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw 将rhK5氨基酸序列输入后，进行氨基酸序列分析和蛋白质空间结构预测，应用RasTop Version 2.1软件获得目标蛋白的三级结构示意图并标示二硫键。分析结果显示(图4)：采用原核表达体系获得的rhK5蛋白能进行正确空间折叠，蛋白分子中的半胱氨酸能进行正确配对连接形成3个二硫键，分别为Cys462:541,Cys483:524和Cys512:536，这与野生型K5完整Kringle结构域形成方式一致。

图4 重组人纤溶酶原kringle 5蛋白一级结构及空间结构示意图

2.5 交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析rhK5蛋白二硫键分布及Kringle结构完整性

在利用生物信息学的方法初步论证rhK5蛋白空间结构的基础上，采用交叉蛋白酶切联合MALDI-TOF/MS进一步分析二硫键定位与分布。研究中所用Trypsin Gold特异性切割位点在Lys(K)和Arg(R)的羧基侧，内蛋白酶-ASP-N特异性切割位点在X(氨基酸残基)-D(Asp)的氨基侧。

如表1所示，rhK5蛋白经Trypsin Gold消化后，理论上可以得到包含二硫键Cys483:524的预期相对分子质量为3 916.20(用ANTHEPROT 4.3推算)的肽段，用MALDI-TOF/MS分析rhK5Trypsin Gold消化产物，证实存在精确相对分子质量为3 916.773多肽，即为目标肽段(图5 A1)；采用TCEP充分还原rhK5 Trypsin Gold消化产物后，MALDI-TOF/MS图谱显示相对分子质量为3 916.773的肽段消失，仅见相对分子质量2 069.662及1 848.488的两个片段(图5 A2)，由此说明在rhK5蛋白的Cys483与Cys524间存在一个二硫键。

rhK5 蛋白经Trypsin Gold和内蛋白酶-ASP-N联合酶切产物在非还原状态和还原状态下的MALDI-TOF/MS图谱以类似的方法证实了另外两个二硫键Cys462:541和Cys512:536的正确形成(图5 B1和B2)，从而说明K5蛋白空间结构正确和Kringle结构完整。

表1 重组人纤溶酶原kringle5经Trypsin和/或endoproteinase Asp-N后的蛋白片段

The molecular weights of the peptide fragment were calculated according to their amino acid sequence with the software of ANTHEPROT 4.3

2.6 rhK5空间结构的圆二色谱分析

纯化的rhK5蛋白，在JASCO-J-810圆二色谱仪上经185～260 nm远紫外线扫描显示，在约230 nm附件出现一个最大负峰，为典型的β折叠型结构(如图4所示)。

3 讨 论

根据重组体构建的原理和人纤溶酶原的氨基酸序列，本研究首先分析了rhK5氨基酸序列，并进一步比较通过蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3获得的理论相对分子质量和通过MALDI-TOF/MS精确测定实际相对分子质量之间的一致性，从而证明重组蛋白一级结构的正确和符合实验设计；在一级结构氨基酸序列基础上采用生物信息学的方法(3D-JIGSAW蛋白质结构数据库)预测了重组蛋白质的结构特征，预测的结果显示了目标蛋白的空间结构符合实验预期。

生物信息学分析能初步说明rhK5蛋白中Cys的正确配对和Kringle结构完整与否。更有说服力的证据需要客观的实验结果。本研究采用交叉蛋白酶切联合MALDI-TOF/MS法对基因工程重组蛋白二硫键的定位和形成进行客观分析。应用Trypsin Gold单独酶切或Trypsin Gold与Endoproteinase Asp-N交叉酶切的方式，消化rhK5蛋白产生的目的片段及其对应的相对分子质量如表1所示。完整的rhK5或酶切后的rhK5，经MALDI-TOF/MS分析得到质谱图。如图3所示，完整rhK5的相对分子质量为12 826.70，这与预测的rhK5相对分子质量12 834.08相符(误差<0.1‰)。经单酶切的rhK5，在非还原状态下可见3 916.7峰(图5:A1)，在还原状态下该峰消失，而出现2069.6和1848.4这两个峰(图5.A2)，由此可证明Cys483-Cys524的存在。经双酶切的rhK5，在非还原状态下可见2441，1628和951这三个峰(图5.B1)，而在还原状态下这三个峰皆消失(图5.B2)，由此可证明K5中的六个半胱氨酸按Cys483-Cys524,Cys462-Cys541及Cys512-Cys536的连接方式形成了3个二硫键。圆二色谱分析其二级结构，发现rhK5的二级结构为β折叠，其结果与前期对Kringle结构域研究的结果一致[8-10]，提示其正确地折叠形成了的空间结构。文中对rhK5蛋白进行生物活性的研究表明rhK5正确地折叠形成了具有生物活性的空间构象。

图5 基质辅助激光解析-飞行时间质谱法分析重组人纤溶酶原kringle 5的二硫键分布

图6 圆二色谱法分析重组人纤溶酶原kringle 5的二级结构特征

相对分子质量是有机化合物最基本的理化性质参数，相对分子质量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。本研究方法的主要理论依据在于MALDI-TOF/MS法能够精确的测定蛋白质的相对分子质量，准确度高达0.1%～0.01%，在这种精确度下，蛋白质与相对分子质量之间存在一一对应关系，在研究中我们也能很容易地根据相对分子质量判断对应的肽段，以及根据相对分子质量的变化分析肽段的变化[11-12]。交叉蛋白酶切联合MALDI-TOF/MS法相对其他生物结构分析方法的优点在于：方法简单、实验周期短，省时、成本低、实验结果直观，易于分析、数据具有说服力。

综上所述，本研究采用交叉蛋白酶切联合MALDI-TOF/MS法证实了rhK5分子中各Cys均是正确配对连接的。本实验证实了关于rhK5重组蛋白一级结构分析、氨基酸序列推测、相对分子质量预算和空间结构的预测都是正确的；同时，它还说明在原核表达体系获得的rhK5蛋白形成了完整的Kringle结构域。这为进一步深入地研究Kringle结构与rhK5的功能关系奠定了方法学基础。同时，本研究从新的角度、采用新的技术手段建立分析蛋白质分子中二硫键的位置和分布的研究方法，具有准确、简单、高效易操作等特点。

参考文献：

[1]WEDEMEYER W J,WELKER E,NARAYAN M,et al. Disulfide bonds and protein folding [J]. Biochemistry,2000,39(15):4207-4216.

[2]仇晓燕，崔勐，刘志强,等. 蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析[J]. 化学进展,2008,20(6): 975-983.

[3]JI W R,CASTELLINO F J,CHANG Y,et al. Characterization of kringle domains of angiostatin as antagonists of endothelial cell migration,an important process in angiogenesis [J]. FASEB J,1998,12(15):1731-1738.

[4]GAO G,LI Y,GEE S,et al. Down-regulation of vascular endothelial growth factor and up-regulation of pigment epithelium-derived factor: a possible mechanism for the anti-angiogenic activity of plasminogen kringle 5 [J]. J Biol Chem,2002,277(11):9492-9497.

[5]李朝阳，温南，杨中汉,等. 人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达[J]. 中山大学学报:医学科学版,2008,29(2):221-225.

[6]YANG X,CHENG R,LI C,et al. Kringle 5 of human plasminogen suppresses hepatocellular carcinoma growth both in grafted and xenografted mice by anti-angiogenic activity [J]. Cancer Biol Ther,2006,5(4):399-405.

[7]CAI W,MA J,LI C,et al. Enhanced anti-angiogenic effect of a deletion mutant of plasminogen kringle 5 on neovascularization [J]. J Cell Biochem,2005,96(6):1254-1261.

[8]COX M,SCHALLER J,BOELENS R,et al. Kringle solution structures via NMR: two-dimensional 1H-NMR analysis of horse plasminogen kringle 4 [J]. Chem Phys Lipids,1994,67-68:43-58.

[9]ULTSCH M,LOKKER N A,GODOWSKI P J,et al. Crystal structure of the NK1 fragment of human hepatocyte growth factor at 2.0 A resolution [J]. Structure,1998,6(11):1383-1393.

[10]MADEREGGER B,BERMEL W,HRZENJAK A,et al. Solution structure of human apolipoprotein(a) kringle IV type 6 [J]. Biochemistry,2002,41(2):660-668.

[11]KELLER B O,LI L. Discerning matrix-cluster peaks in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectra of dilute peptide mixtures [J]. J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(1):88-93.

[12]伍小云，张嘉杰，吴曙光. VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂的三维定量构效关系研究[J]. 中山大学学报:自然科学版,2010,49(1):57-61.