丹黄消炎膏提取工艺的研究

刘雪平，胡 君

糖尿病足或肢端坏疽是糖尿病的严重并发症之一，也是目前医学领域的一大顽症，在中医学属“消渴”、“脱疽”范畴。千百年来，中医治疗糖尿病足大都采用中药内服、外洗等方法。药物贴敷疗法有着几千年的历史渊源，是源于“天然医学”的中药透皮吸收的绿色疗法之一，具有适应症广、操作简便、疗效明显、经济安全的4大优点。

外用丹黄消炎膏是本院外科在中医整体辨证分型内治的基础上研制纯中药制剂，临床外用于糖尿病足坏疽创面,疗效较好，功能强调扶祛邪、祛腐生新，组方治则为扶正脱毒，活血解毒。临床用于糖尿病足坏疽。其处方中含有金银花、当归、黄柏等药材，绿原酸是本品有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、解热、升高白细胞、保肝利胆、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。

笔者借鉴传统的水煎煮提取方式，取影响水煎煮提取的主要因素即煎煮次数、加水量、煎煮时间3个因素，各取3个水平进行L9（34）正交实验。以丹黄消炎膏提取干膏率及处方中的主要药效物质绿原酸含量为综合评价指标，筛选丹黄消炎膏的最佳提取工艺。

1 实验材料

1.1 实验仪器 岛津高效液相色谱仪LC—10ATVP（岛津仪器（苏州）有限公司N2000数据工作站），SPD—10A VP（浙江大学智能信息研究所）；色谱柱IrreguLar-H C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；梅特勒—多利托电子天平AG—135（瑞士）（天津三维公司）。

1.2 药品与试剂 绿原酸对照品：（中国药品生物制品检定所购置，批号：110753—200413）；药材（天津饮片厂），乙腈（色谱纯），磷酸（色谱纯），纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 正交实验设计 根据传统提取方法以及药材所含成分的理化性质的需要，选定提取时间、加水量、提取次数作为考察因素,以样品的干膏率及绿原酸含量综合评分为考察指标，采用L9（34）正交表设计进行实验方案，因素水平安排见表1。

表1 正交因素水平表

2.2 丹黄消炎膏提取液（简称提取液）的制备 称取处方量的各药材共9份，按L9（34）正交实验表各列所示条件提取，滤过，合并滤液浓缩至100 mL，备用。

2.3 提取液干膏率测定方法 分别精密吸取提取液样品各25 mL，置于恒质量蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，移至干燥器内冷却30 min，精密称定，依公式：

2.4 绿原酸的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱IrreguLar-H C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速：1 mL/min；检测波长为327 nm；柱温：室温。理论板数按绿原酸峰计算应不低于4 000。

2.4.2 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含49.6μg的溶液，即得。

2.4.3 线性关系考察 精密称取绿原酸对照品12.5 mg加甲醇使溶解并定容于25 mL容量瓶中，摇匀，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液 1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL 分别置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得不同浓度的对照品溶液。吸取各浓度的溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以峰面积-浓度绘制标准曲线，得回归方程：Y=7.02×10-8X，r=0.999 8。

结果表明，绿原酸的进样量在0.2～2 μg之间与峰面积有良好的线性关系。

2.4.4 供试品溶液的制备及测定 取提取液1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，0.45 μm滤膜滤过，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表2。

表2 正交实验方案及测定结果

2.4.5 加样回收率实验 采用加样回收法，已知绿原酸浓度（2.97g/L）的提取液6份，分别置于50 mL容量瓶中，加入精密称定的适量绿原酸对照品，加甲醇稀释到刻度，摇匀，滤过，测定，结果平均回收率为101.06%，RSD为1.846%。

2.4.6 重复性实验 取同一供试品溶液，在2.4.1色谱条件下进行测定，重复进样6次，记录峰面积值，结果相对标准偏差（RSD）为1.40%，表明本法重复性良好。

2.4.7 重现性实验 取同一提取液6份，按2.4.4方法制得各供试品溶液，在2.4.1色谱条件下进行测定，6份样品含量的重现性良好，RSD为3.0%。

2.4.8 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h 测定峰面积。结果 RSD 为1.93%,表明本溶液24 h内稳定性符合要求。

2.4.9 验证实验 根据筛选得到的最佳工艺提取3批样品，测定绿原酸含量。

3 结果

3.1 正交实验结果 对正交实验结果作方差分析，所得方差分析结果见表3。

表3 方差分析表

直观分析结果表明，在所考察的影响因素中，重要性依次为A>B>C。A因素中A3>A2>A1；B因素中B3>B2>B1；C因素中C1>C3>C2。方差分析结果表明：A因素的影响具有统计学意义（P＜0.05）；B 因素、C 因素的影响无统计学意义（P＞0.05）。考虑生产成本因素，因此，确定最佳提取条件为A3B2C3，即加10倍量水，提取3次，每次2 h。

综合评分=干膏率评分×0.4+绿原酸含量评分×0.6。

3.2 验证实验结果 根据筛选得到的最佳工艺A3B2C3提取3批样品，测定干膏率和绿原酸含量，结果平均干膏率为38.783 3%，绿原酸平均含量为（3.877 7g/L），验证实验结果均高于正交实验，说明所筛选的提取工艺条件稳定可行。

4 讨论

4.1 检测波长的测定 取绿原酸对照品溶液在190～600 nm进行光谱扫描，绿原酸在327 nm处有最大吸收峰，根据《中国药典》[1]2005年版一部金银花项下，最终确定327 nm为检测波长。

4.2 流动相的选择 作绿原酸测定时，最常用的是乙腈∶0.4%磷酸，通过试用不同比例的流动相测定，发现比例为乙腈—0.4%磷酸（12∶88）时可使色谱峰与相邻峰达到基线分离，方法简便，结果准确。

4.3 绿原酸含量测定有干扰 本实验在进行绿原酸含量测定时候发现绿原酸有干扰，随即提取了黄柏、金银花双阴性样品及黄柏药材样品进行测定，结果发现双阴性样品亦略有干扰，经查阅文献得知可能是皂角刺造成，然后制备了金银花、黄柏、皂角刺三阴性样品及皂角刺药材样品，分别进样10 μL测定，结果三阴性样品无干扰。见图1-3。

有关皂角刺、关黄柏中绿原酸的含量测定有待进一步实验研究，本文不再赘述。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社，2005:152.