二苯乙烯苷及其β-环糊精包合物在大鼠体内药代动力学研究*

欧阳慧子，任晓亮，王 强，王贵芳，赵 敏，戚爱棣

中药何首乌（Polygoni multiflori Radix）源于蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块茎，其特有指标性成分二苯乙烯苷（THSG），即2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2，3，5，4-tetrahydroxyl-diphenylethylene-2-O-glu coside）（见图1），具有抗肺肿瘤，抗动脉粥样硬化，降低胆固醇和血脂，提高免疫力等多种药理活性[1-4]。但由于THSG具有水溶液中稳定性差、体内生物利用度低的特点，在一定程度上限制了其临床上的应用[5]。β-环糊精（β-CD）作为经济易得的药用辅料，其安全性已被美国食品和药物管理局（FDA）认证[6-7]。β-CD可以将药物分子包入其空腔内，减小外部物理化学环境对其稳定性的影响，继而对药物起到保护性作用[8-9]。笔者利用β-CD对THSG进行包合，发现β-CD改性后的THSG体外稳定性有显著提高，本研究对大鼠灌胃THSG及其β-CD包合物的药代动力学行为进行研究，揭示β-CD包合作用对THSG体内过程的影响，为THSG制剂开发以及临床前应用奠定基础。

1 材料及方法

1.1 仪器 Waters 600E高效液相色谱系统（美国Waters公司）；AX205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；N-EAVPTM111氮吹仪（美国Organomation公司）；高速离心机（美国Tomos公司）；超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂 THSG对照品（批号：110844－200606，中国药品生物制品检定所）；黄芩苷对照品（批号：110715－200212，中国药品生物制品检定所）；THSG提取物[自制，采用硅胶柱层析分离、重结晶纯化制得，薄层色谱分析（TLC）显示为单一斑点，二胺基联苯胺（DAD）显示为单一化合物峰，高效液相色谱（HPLC）法测定其纯度≥96%]；β－CD（孟州市华兴生物化工有限责任公司）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；超纯水（美国Millipore超纯水制备系统）。

1.3 实验动物 健康SD大鼠，级别SPF，雄性，体质量200～220g，购自中国医学科学院放射医学研究所，许可证号：SCXK（津）2005－000。

1.4 包合物的制备 1g THSG提取物加入300 mL β-CD溶液（9 mol/L），10℃下避光搅拌6 h，4℃静置过夜后减压回收溶剂得包合物粉末，用少量乙醇洗涤后真空干燥，得到包合物粉末。经热重分析-差示量热分析证实了THSG-β-CD包合物的形成，并用HPLC法测定该包合物中二苯乙烯苷含量为30.9%。

1.5 血浆样品预处理 取大鼠血浆250 μL，精密加入50μL甲醇，50μL内标溶液（黄芩苷，1.4mg/L），涡旋10秒，加入0.2 mol/L的盐酸溶液50 μL，涡旋1min，再加入甲醇750μL，涡旋3 min后14 000 r/min离心10 min。取上清液，氮气吹干后，100 μL流动相复溶，14 000 r/min离心5 min，取上清液10 μL进样分析。

1.6 色谱条件 色谱柱：Warers SymmetryShieldTM RP－C18（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水－磷酸[25∶75∶0.05；V∶V∶V]；流速：1.0 mL/min；检测波长：320 nm；柱温：室温。

1.7 药代动力学研究 20只大鼠随机分成2组，每组10只，给药前禁食12 h，自由摄水。按75 mg/kg（以THSG含量计算）的剂量，分别灌胃THSG-β-CD包合物溶液和THSG水溶液。其中每组5只均于给药后 2、10、30、60、120、240 min，另 5 只于 5、20、40、90、180、360 min 从大鼠眼底静脉丛取血，置肝素化试管中，离心（3 500 r/min）10 min，分离血浆，储存于-20℃待测。

2 结果与讨论

2.1 特异性考察 分别取5只大鼠空白血浆各250 μL，除不加内标溶液外，其余按“1.6”项下血浆样品预处理操作和分析，得空白血浆色谱图（见图2A），将一定浓度待测物的对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，获得相应的色谱图（见图2B），THSG和内标的保留时间分别为3.95 min和8.25 min，依同法获得灌胃给予THSG后的血浆色谱图（见图2C）。结果表明，血浆中内源性物质不干扰THSG和内标的测定。

2.2 标准曲线 取空白血浆各250 μL，加THSG对照品系列溶液50 μL，配制成相当于血浆浓度为0.025、0.050、0.10、0.20、0.80、1.60、3.20 mg/L 的 3 批血浆样品，除不加50 μL甲醇外，按“1.5”项下样品处理操作；以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程为Y=7.703 4X-0.161，r=0.998 7。根据标准曲线，THSG的线性范围为0.025～3.20 mg/L，定量下限为0.025 mg/L。

2.3 精密度与准确度 分别取大鼠空白血浆250 μL，按“2.2”项下方法配制成浓度为 0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高浓度质量控制（QC）样品各6份，与标准曲线同时测定，连续测定3 d，即每个浓度有18个样品。根据当日的标准曲线，计算QC样品的测得结果，进行方差分析，计算本法的准确度与精密度，结果见表1。

表1 HPLC法测定大鼠血浆中THSG的精密度与准确度

2.4 提取回收率 分别取浓度为0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高浓度血浆样品各6份，按上述方法处理操作后进样分析；同时以相应对照品溶液50 μL和内标溶液50 μL加入处理过的大鼠空白血浆样品涡流混合后进样分析得峰面积，提取后的峰面积与之相比，比值计算提取回收率。大鼠血浆中3种浓度的THSG提取回收率分别为82.8%，83.5%和86.5%；内标提取回收率为62.3%。

2.5 稳定性 取大鼠空白血浆250 μL，按“2.2”项下的方法配制成浓度为0.20 mg/L的血浆样品，考察其在避光室温放置4 h内的稳定性、血浆样品1次和3次冷冻—解冻循环以及处理后样品室温放置24 h内的稳定性。结果表明血浆样品在不同条件下RSD均小于3.0%，表明大鼠血浆样品在室温避光，冷冻保存放置8 h内稳定。

2.6 药代动力学研究 SD大鼠灌胃THSG及包合物后,THSG的平均血药浓度经时曲线见图3。血药浓度数据用 DAS（Drug And Statistic 1.0）进行拟合，计算药代动力学参数，结果见表2。β-CD对THSG的改性作用对其药代动力学过程有明显的影响，主要表现为：1）达峰时间提前，THSG经β-CD包合后在体内吸收速度加快。2）达峰浓度增高，大鼠灌胃THSG后的Cmax为 0.24 mg/L；THSG-β-CD组的Cmax为 1.16 mg/L。3）THSG-β-CD 组的药物在体内停留趋势比THSG组增加，MRT分别为89.01 min和72.76 min。4）β－CD包合物给药后6 h THSG的AUC值是单独给予THSG的近3倍，表明β-CD包合可显著提高THSG口服生物利用度。

3 讨论

THSG经β-CD改性后口服生物利用度明显提高，吸收半衰期变短，消除半衰期延长，药物从体内的表观清除速率降低。推测可能由于THSG经β-CD包合后其生物稳定性增加，避免了药物的分解和酶解。此外，β-CD可提高小肠细胞的膜通透性，增加药物的吸收量，使药物达峰时间提前且生物利用度提高。在胃肠环境中包合物与游离态THSG处于动态平衡状态，随着游离THSG的吸收，包合物中的THSG不断向环境中释放，从而使得胃肠道环境中的THSG维持一个较高的浓度，增加了药物在肠道中的吸收时间，提高了THSG的吸收效果。β-CD还可被结肠部位的肠道菌群所降解而释放出药物，使其携带药物在到达结肠后才被释放吸收，增加药物的吸收部位。

图3 大鼠灌胃给予THSG和THSG-β-CD包合物血药浓度-时间曲线

表2 THSG及其β-CD包合物主要药动学参数（±s，n=5）

表2 THSG及其β-CD包合物主要药动学参数（±s，n=5）

注：与 THSG 比较，*P<0.05。

药代动力学参数 THSG THSG-β-CD Tmax（min） 9.00± 2.24 5.00± 0.00 Cmax（mg/L） 0.24± 0.09 1.16± 0.80*AUC0-360min[mg/（L·min）]11.50±3.9732.24±7.77*MRT（min） 72.76± 7.99 89.01± 22.99 VRT（min） 2 963.10±241.84 8 698.29±2 454.49*

THSG体内降解产物分析：大鼠灌胃给予THSG后，血浆样品的色谱图中除THSG色谱峰外，还出现了2个新的色谱峰（tR分别为2.3 min和3.5 min，THSG为4.0 min）。此2个色谱峰的面积随时间变化具有一定规律性，推测为THSG在大鼠体内代谢产物色谱峰。其中tR=3.5 min的代谢物最为明显，含量较高，推测是THSG在体内最主要的代谢产物，通过后期胆汁排泄研究，证明其为THSG葡萄糖醛酸结合代谢产物。

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