骨乐宁胶囊对大鼠骨折模型VEGF的影响*

任守平，张荣位，金鸿宾

300211 天津医院创伤中心（金鸿宾）

如何促进骨折愈合，防止骨折延迟愈合或骨不连的发生，是当今骨科研究的重要课题之一。近年来随着基础学科的发展，有关中药促进骨折愈合的研究工作取得了长足的进步[1]，凸显出中医中药辨证施治促进骨折愈合优势。

1 材料与方法

1.1 实验动物与骨折模型制作 4月龄Wister大鼠64只（合格证号SCXK津2009-0001），雌雄各半，平均体质量为（230.00±37.35）g。购入后适应性饲养1周，然后用乌拉坦腹腔内注射麻醉，无菌操作，于右胫骨结节下2 mm处由前向后以磨钻磨除胫骨前2/3骨质，仅保留髓腔后侧皮质骨，形成约3 mm×4 mm近横断骨缺损区造模，术后腹腔注射硫酸庆大霉素2天以预防感染。标准饲料常规饲养（由天津中医药大学实验中心提供），自由摄食、饮水。

1.2 治疗药物 骨乐宁胶囊：当归、黄芪、熟地黄、白芍、川芎、柴胡、赤芍、桃仁、红花等组成。由天津中医药大学附属北辰中医院制剂科制作提供。每粒含生药0.3g。

骨折挫伤胶囊：哈尔滨华雨制药有限公司生产中成药，批号ZZ-5434-黑卫药准字（1989）第300127号。主要成份有：红花、大黄、当归、乳香、没药、血竭、土鳖虫、自然铜等。每粒含生药0.29g。

1.3 分组治疗与标本采集 造模后的大鼠按随机数字表法随机分为4组：骨乐宁高剂量组、骨乐宁低剂量组、骨折挫伤胶囊组、空白对照组，每组16只。按人与大鼠体质量换算系数5.1计算，骨乐宁高剂量组用量为0.55mg/（g·d），骨乐宁低剂量组为0.30 mg/（g·d），骨折挫伤胶囊剂量为0.46 mg/（g·d）。造模术后第1天起按上述用药量的蒸馏水混悬液灌胃给药，每日1次；空白对照组给予等容量生理盐水灌胃。

全部实验动物分别于治疗 7、14、21、28 d 时，分4批拉颈处死，截取模型骨段，剔除胫骨周围软组织，20%中性福尔马林液固定24 h，再经脱水、脱钙、切片、染色后观察。

1.4 检测方法 采用卵白素—生物素复合技术进行免疫组化染色显示血管内皮生长因子（VEGF）表达阳性细胞。严格按照试剂盒（上海西唐生物技术公司）说明要求操作，石蜡切片脱蜡至水后，3%双氧水（H2O2）消除内源性过氧化物酶的活性，再行抗原热修复，正常山羊血清封闭。滴加一抗、二抗等多重孵育，最后用二甲氨偶氮苯（DAB）显色剂显色，复染，封片。每骨切片在400倍镜下取5个视野，统计每个视野中的阳性染色细胞数，再取其平均数作为个体阳性细胞统计数并以Image-Pro图像处理系统计算其染色面积。

1.5 统计学处理 全部数据用SPSS 11.0进行统计分析，组间差异采用两样本均数的t检验进行判断，P＜0.05，P＜0.01为差异有统计学意义。结果采用均数±标准差表示（±s）。

2 结果

骨折模型在不同时点骨痂中VEGF的表达。染色结果显示在骨小梁及成骨细胞中着色，细胞浆呈棕黄色颗粒样改变，而细胞核呈淡蓝色，深棕黄色者为强阳性，浅黄色者为弱阳性，无着色颗粒者为阴性。可以看出VEGF在伤后第7天时即已有表达，但仅在少数成骨细胞、内皮细胞等细胞中；第14天时达到峰值，在血管内皮细胞、软骨细胞及成骨细胞均为强阳性表达，第28天时阳性表达细胞数明显减少。这一过程在相应的阳性细胞染色面积统计上表现得更为突出，且与相关研究具有一致性[2-3]。总体在4个检测时点的骨痂切片中骨乐宁胶囊高剂量组VEGF表达较其他各组强，空白对照组表达最弱，见表1和表2。

表1 骨痂切片VEGF染色阳性细胞计数（±s） 个/视野

表1 骨痂切片VEGF染色阳性细胞计数（±s） 个/视野

注：与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01，与骨折挫伤组比较：#P<0.05。

组别 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨乐宁高 15 32.90±3.4 59.20±5.5**50.00±3.1*# 27.50±0.3骨乐宁低 16 27.10±2.9 43.70±3.0 39.50±4.2 22.70±1.9骨折挫伤 16 29.20±4.2 48.80±1.7* 36.80±4.3 21.80±2.2空白对照 14 22.20±3.0 36.80±2.5 34.00±3.9 20.90±2.6

3 讨论

人体气血循行于周身，外而营养皮肉筋骨，内而灌溉五脏六腑。故当肢体受跌扑打击外伤之时，皮肉筋骨虽首当其冲的同时必然伤及气血，外而为肿为痛，内而脏腑功能失调。正如《正体类要》序中所指出“肢体损伤于外则气血伤于内，营卫有所不贯，脏腑由之不和”。血瘀气滞所致的伤处肿痛实乃外伤之标，而气血脏腑功能失和才是伤病之本。治疗则需气血标本兼顾。有实验研究证明中药在骨折愈合的不同阶段有着不同的作用及机制，过多使用活血化瘀药可破坏骨折愈合自身相对稳定的血氧代偿机制，不利于新生血管的形成从而影响骨折愈合。骨乐宁胶囊立方旨在通过益气活血以达到瘀去新生促进骨折愈合的目的。

表2 骨痂切片VEGF染色阳性细胞面积（±s）

表2 骨痂切片VEGF染色阳性细胞面积（±s）

注：与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01，与骨折挫伤组比较：#P<0.05，##P<0.01。

×10-10m2/视野组别 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨乐宁高 15 131.5±23.4**205.6±30.2**##174.6±18.2*#91.7± 9.6骨乐宁低 16 110.8±11.7 145.9±21.4 135.9± 9.7 78.9±14.1骨折挫伤 16 118.5±17.3* 159.9±14.3* 129.7±12.5 74.6±12.1空白对照 14 86.3±14.8 125.1±23.4 116.5±14.4 70.3±11.8

[1]任守平，金鸿宾.中药对骨折愈合相关细胞因子作用的研究进展[J].天津中医药，2010，26（6）：527－529.

[2]初同伟，王正国，朱佩芳，等.血管内皮生长因子在骨折愈合中的作用[J].中国修复重建外科杂志，2002，16（2）：75.

[3]任守平，金鸿宾.骨乐宁胶囊早期促进骨折愈合的临床研究[J].天津中医药，2010，26（4）：323－324.