RP－HPLC法测定传统朝医方两仪煎中梓醇的含量

王玲玲 徐 影 金香淑 姜英子

吉林省延边大学，吉林 延吉 133000

两仪煎由山茱萸和地黄两味药材组成。本方作为传统朝医方记载于新《东医保鉴》，根据朝医药理论，该制剂具有补肾益精的功能，用于玉茎冷痛证疾病治疗［1］。近年来，金香淑等到研究两仪煎对慢性肾功能衰竭 (CRF)患者肾功能的影响及临床疗效，实验研究表明两仪煎具有益肾补脾、化浊祛淤之功效，全方体现了扶正祛邪、标本兼顾的原则［2］。

处方中的熟地黄为玄参科多年生草植物地黄 (Radix Rehmanniae)的根的炮制品，为清热凉血药，具有明显的抗炎、调节免疫的功能。化学成分以环稀醚萜苷类为主，主要有梓醇、二氢梓醇等。其中，梓醇为主要有效成分之一，具有降血糖、缓泻、滋阴、抗炎和抗肝炎病毒［6］等多种生物活性［3－5］，亦是主要水溶性成分。测定其含量，可为地黄及其制剂提供质量控制的有效手段。本实验采用高效液相色谱法，选择地黄以梓醇为含量控制指标，为对两仪煎中梓醇进行了含量测定条件摸索，经方法学考察及阴性对照试验，表明此法专属性较强，重现性好，方法简便、准确、灵敏度高，可作为本品内在质量控制的有效方法。

1 仪器与试剂

日本岛津LC－10A高效液相色谱仪 (包括SPD－10A紫外检测器);奥特赛思仪器有限公司AS3120A型超声波清洗脱气器;TG332A型微量分析天平 (Sartorius);98－1－B型电子调温电热套 (天津市泰斯特仪器有限公司);梓醇购自天津金测分析技术有限公司;甲醇为色谱醇;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取梓醇对照品适量，加流动相制成每1mL含9.5μg梓醇的混合溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

照处方比例取熟地黄0.40g和山茱萸0.20g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水25ml，加热回流提取1h和45 min，合并续滤液，浓缩至近干。用流动相超声溶解于25 ml容量瓶中，定容，用 0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(5μm，250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈－水 (1:99);流速:1.0 ml/min;柱温为40℃;检测波长:210 nm。在此条件下，对照品及样品色谱图见图1。

图1 HPLC图

2.3 线性关系考察

吸取上述对照品溶液 5，10，15，20，25，30，35 μl进样，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量 (X，L)为横坐标，绘制标准曲线。梓醇回归方程为:Y=2424.5X+1168.3(r=0.9995)，线性范围为0.0475 ～0.3325 μg，见图2。

图2 线性关系曲线

2.4 精密度试验

取上述对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，进样量20μl，测定梓醇的峰面积，RSD(n=6)为0.70%，说明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

照处方比例制备6个模拟批号样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.2”项下分别吸取供试品溶液20μL注入色谱仪测定含量，结果梓醇的平均含量 (n=6)分别为0.50mg/g;RSD为1.43%。表明本法具有良好的重复性。

2.6 稳定性试验

取处方供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样20μL，测定梓醇的峰面积，结果梓醇的峰面积RSD(n=6)为1.38%，表明供试品溶液在24h小时内基本稳定。

2.7 加标回收率试验

精密称取已知含量的样品 (梓醇0.50mg/g)，分别定量加入梓醇标准品，按“2.1.2”制备供试品溶液，依“2.2”项下色谱条件精确进样20μL，测定梓醇的量，计算平均回收率为100.48%;RSD为1.83%，结果见表1。

2.8 样品含量测定

照处方比例制备5个模拟批号样品，按“2.1.2”制备供试品溶液，依“2.2”项下色谱条件测定，梓醇的含量为0.50mg/g。

表1 回收率测定结果 (n=9)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备条件的选择 在色谱条件选择中，紫外扫描梓醇溶液在190～400nm的最大吸收在210 nm，与文献报道［7］相同。在提取试验中，由于是传统方剂，与临床用药相接近，所以选用了水提取，提取时间考察了40，60，90，135min对含量测定的影响。考虑到与临床相符，最后选择1小时和45分钟为提取时间。经重复性及加样回收率试验，表明本方法可行。

3.2 流动相的选择 曾根据文献报道［7］进行了反复试验，当减少水的含量而增加乙腈的含量时，虽然洗脱能力增强，但分离度差;只有增加水的含量达到水一乙腈 (99∶1)时，梓醇峰才达到基线分离且梓醇的峰形较好，保留时间在15min内。同时考查了不同流速 (0.8、1.0、1.2 ml·min－1)对分离结果的影响，最终以流速1.0 ml·min－1最为理想。

3.3 根据5批模拟批号样品的含量测定，两仪煎中梓醇的平均含量为0.50mg/g。因此，可暂定传统朝医方两仪煎中含熟地黄以梓醇 (C15H22O10)计不得少于0.50%。

［1］崔松男．朝药志［M］．延边人民出版社，1995:250．

［2］金香淑，李金花，金贞姬．朝医四象方两仪煎对慢性肾功能竭治疗作用的研究［J］．时珍国医国药．2007，18(1):57－58．

［3］汪程远，张浩，孟莉，等．HPLC测定地黄及其制剂中梓醇的含量［J］．华西药学杂志，2003，182(2):134－135．

［4］顾清，唐迎雪，张建．RP－IIPLC法测定四生口服液中梓醇的含量［J］．中国药师，2006，9(3):244．