玉米麸皮中阿魏酰低聚糖的制备

潘海晓, 刘海顺, 王 静, 赵 冰, 苏 颖

玉米是世界三大粮食作物之一,它含有较多的酚类化合物,如:阿魏酸、香草酸和香豆酸等.酚酸都有很强的抗氧化活性,对于延缓人体衰老有显著的作用.玉米麸皮中主要含有阿魏酸,其含量为0.4%～3.6%[1-3].在植物中,阿魏酸主要通过酯键与细胞壁多糖和木质素交联,自身酯化或醚化形成双阿魏酸.与其他植物细胞壁不同的是,玉米麸皮表面存在大量的纤维素、半纤维素,这严重影响酶解效率,而且研究发现,玉米麸皮中的阿魏酰低聚糖的结构也相当复杂[4-9].

阿魏酰低聚糖(feruloylated oligosaccharides,FOs)是低聚糖中不同位置上的糖羟基与阿魏酸羧基酯化形成的一类化合物.阿魏酰低聚糖由于既具有阿魏酰基又具有亲水性的低聚糖基团,因而具有较好的水溶性和耐热性.近年来,虽然人们对天然抗氧化剂的研究比较多,但由于许多天然抗氧化剂不溶于水、不耐热,因此阿魏酰低聚糖的生物活性已经引起了人们的研究兴趣.研究发现,阿魏酰低聚糖的抗氧化性高于阿魏酸与VC,而且它可以体外抑制Cu2+诱导人体脂蛋白的过氧化反应,保护正常小鼠红细胞免受氧化应激的伤害,是一种潜在的抗氧化剂[10-15].

本研究用廉价的玉米麸皮作原料,制备具有生理功能的阿魏酰低聚糖,以期为玉米加工副产物玉米麸皮的综合利用提供一条新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米麸皮,中储粮北京分公司承德粮油质检中心,粉碎后过40目筛待用;耐高温α-淀粉酶,北京奥博兴生物技术有限责任公司;糖化酶,北京奥博兴生物技术有限责任公司;碱性蛋白酶,诺维信公司;木聚糖酶,武汉新华扬生物有限公司;纤维素酶,北京宁馨儿生物科技开发有限公司;其他化学试剂均为分析级.

1.2 仪器与设备

SHZ-82型水浴恒温振荡器,江苏省金坛市荣华制造有限公司;HH SY11-Ni2B型电热恒温水浴锅,北京市长风仪器公司;JJ-1型精密增力电动搅拌器,常州国华电器有限公司;Spectrumlab 53型紫外-可见分光光度计,上海棱光技术有限公司;SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 玉米麸皮不溶性膳食纤维制备

在文献[15]和文献[16]制备玉米膳食纤维方法的基础上,进行了修改:玉米麸皮100 g用粉碎机粉碎后,过40目筛,用高压蒸气在121℃处理,后取出加入1 000 mL馏水,60℃下搅拌20 h,使其充分溶胀.加入耐高温α-淀粉酶、碱性蛋白酶和糖化酶将玉米麸皮酶解,将混合物沉淀,弃去上清液,用热水,冷水清洗沉淀,至上清液无明显混浊,再用酒精和丙酮洗涤,最后放置在真空干燥箱内45℃晾干.

1.3.2 玉米不溶性膳食纤维中阿魏酸含量的测定

10 mg玉米不溶性膳食纤维加入0.5 mL 2 mol·L-1氢氧化钠,在摇床里反应 2 h,转速 150 r/min,后加入0.3 mL 3.5 mol·L-1的磷酸调 pH 值到2.0.用乙酸乙酯萃取5次,每次加入乙酸乙酯1.6 mL,离心5 min,转速1 000 g,上清液被放置在真空干燥箱内45℃晾干,在325 nm下用紫外分光光度计测其吸光值.

1.3.3 阿魏酰低聚糖的酶解工艺

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分别以纤维素酶、木聚糖酶浓度、反应时间、底物浓度为变量,先后进行单因素和正交试验,探索得到利用玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖的最优条件.

1.3.3.1 单因素实验

1)最适反应时间的确定.称取3 g玉米不溶性膳食纤维到100 mL三角瓶中,加入0.12 g木聚糖酶和0.24 g纤维素酶,再加入30 mL MOPS缓冲液(50 mmol/L,pH值为5.0),反应混合物置于一台恒温水浴摇床内,60℃下分别反应12,24,36,48,60 h,振荡器转速设为150 r/min.

2)最适纤维素酶量的确定.称取3 g玉米不溶性膳食纤维到100 mL三角瓶中,加入0.12 g木聚糖酶,再分别加入0.12,0.18,0.24,0.30,0.36 g纤维素酶,后加入30 mL MOPS缓冲液(50 mmol/L,pH值为5.0),反应混合物置于一台恒温水浴摇床内,60℃下反应36 h,振荡器转速设为150 r/min.

3)最适木聚糖酶量的确定.称取3 g玉米不溶性膳食纤维到100 mL三角瓶中,加入0.24 g纤维素酶,再分别加入0.06,0.12,0.18,0.24,0.30 g木聚糖酶,后加入30 mL醋酸缓冲液,反应混合物置于一台恒温水浴摇床内,60℃下反应48 h,振荡器转速设为150 r/min.

4)最适底物浓度的确定.分别称取1～5 g玉米不溶性膳食纤维到100 mL容量瓶中,加入0.3 g纤维素酶和0.3 g木聚糖酶,再加入30 mL pH值为5.0的醋酸缓冲液,反应混合物置于一台恒温水浴摇床内,60℃下反应36 h,振荡器转速设为150 r/min.

1.3.3.2 正交试验

为了探索酶解玉米麸皮获得阿魏酰低聚糖的最佳条件,参考单因素实验结果,采用正交表L9(43)设计正交试验,试验的因素水平见表1.

表1 玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖正交试验因素水平表Tab.1 Design of orthogonal test in preparation of feruloyl oligosaccharides from maize bran

将酶解后的物质从恒温水浴摇床取出后,在高压锅内100℃灭酶活10 min,后进行抽滤,收集滤液,并将滤液过0.45μm超滤膜,将得到的液体采用双波长法在286 nm和325 nm下测定其吸光值,计算得到阿魏酰低聚糖的浓度.

2 结果与讨论

2.1 玉米麸皮膳食纤维制备阿魏酰低聚糖的单因素实验结果

2.1.1 反应时间对阿魏酰低聚糖产量的影响

反应时间对阿魏酰低聚糖产量的影响如图1.由图1可以看出,随着时间的增加,阿魏酰低聚糖的产量逐渐增加,反应36 h,产量达到了最大值,之后随着时间的增加,阿魏酰低聚糖产量有所下降,反应50 h后趋于平缓.这是因为随着时间的延长,阿魏酰低聚糖进一步酶解为小分子的糖类,而导致其产量下降,后来随着时间进一步延长,酶解效率达到极限,阿魏酰低聚糖含量基本达到平衡.通过单因素实验我们得到,制备阿魏酰低聚糖的最佳时间为反应36 h.

图1 反应时间对阿魏酰低聚糖浓度的影响Fig.1 Effect of reaction time on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.2 木聚糖酶浓度对阿魏酰低聚糖产量的影响

木聚糖酶浓度对阿魏酰低聚糖产量的影响结果如图2.由图2可以看出,随着木聚糖酶质量浓度的增加,阿魏酰低聚糖的产量也在逐渐增加,当酶质量浓度达到6 g/L的时候,阿魏酰低聚糖的产量便不再随着酶质量浓度的增加而增加.这是因为随着木聚糖酶酶量的增加,更多的半纤维素降解,阿魏酰低聚糖产量增加,木聚糖酶酶量继续增加,酶解反应达到平衡,阿魏酰低聚糖含量不再增加.通过单因素实验,我们得到制备阿魏酰低聚糖的最佳木聚糖酶质量浓度为6 g/L.

图2 木聚糖酶浓度对阿魏酰低聚糖质量浓度的影响Fig.2 Effect of xylanase concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.3 纤维素酶浓度对阿魏酰低聚糖产量的影响

纤维素酶浓度对阿魏酰低聚糖产量的影响如图3.由图3可以看出,随着纤维素酶浓度的增加,阿魏酰低聚糖的产量在逐渐增加,当酶质量浓度达到8 g/L时,阿魏酰低聚糖产量达到最大值,后随着纤维素酶浓度的增加,阿魏酰低聚糖的产量几乎不变.这是因为,刚开始随着纤维素酶浓度的增加,大量的不溶性膳食纤维降解为可溶性膳食纤维,木聚糖酶能够更好地作用于半纤维素,因此阿魏酰低聚糖的含量增加,后随着纤维素酶浓度的增加,纤维素酶降解细胞壁能力达到极限,阿魏酰低聚糖含量基本不变.由单因素实验得到制备阿魏酰低聚糖的最佳纤维素酶质量浓度为8 g/L.

图3 纤维素酶浓度对阿魏酰低聚糖浓度的影响Fig.3 Effect of cellulose concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.4 底物浓度对阿魏酰低聚糖产量的影响

底物浓度对阿魏酰低聚糖产量的影响如图4,由图4可以看出,在其他条件一定的情况下,随着底物浓度的增加,阿魏酰低聚糖的产量在逐渐增加,当底物质量浓度达到133 g/L的时候,阿魏酰低聚糖的产量达到最大值,后随着底物浓度的增加,阿魏酰低聚糖的产量下降,这是因为料液比太高,混合液太过粘稠,酶不能够很好地与底物接触,从而导致阿魏酰低聚糖的产量下降.由单因素实验得到制备阿魏酰低聚糖的最佳底物质量浓度为133 g/L.

图4 底物浓度对阿魏酰低聚糖浓度的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.2 玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖的正交试验结果

在单因素实验的基础上,采用正交表设计正交试验,探索利用玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖的最佳条件,结果如表2.

表2 玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖正交试验结果Tab.2 Result of orthogonal test in preparation of feruloyl oligosaccharides from maize bran

运用极差对数据进行分析得到结果:RB＞RA＞RC＞RD,极差R的值越大,说明该因素的效应越大,从正交试验可以得到制备阿魏酰低聚糖的主次因素依次是:底物浓度＞反应时间＞木聚糖酶浓度＞纤维素酶浓度.最佳因素水平为A3B3C1D2,考虑到实际情况,反应时间太长,不利于工业化生产,因此反应时间选择36 h,即制备玉米麸皮阿魏酰低聚糖的最佳反应条件:底物质量浓度为165 g/L,木聚糖酶质量浓度6 g/L,纤维素酶质量浓度8 g/L,反应时间36 h,pH值为5.0,温度60℃,得到的阿魏酰低聚糖浓度为2.127 mmol/L.

3 结 论

1)将玉米麸皮进行高压处理,20 h的搅拌处理可以使玉米麸皮充分溶胀,后经酶解得到玉米麸皮不溶性膳食纤维,克服了玉米麸皮表面细胞壁坚硬,酶解反应效率低的缺陷.

2)利用纤维素酶辅助木聚糖酶反应制备阿魏酰低聚糖,由于玉米麸皮表面存在大量的纤维素、半纤维素,这严重影响木聚糖酶酶解效率,采用纤维素酶水解其中的纤维素,使得木聚糖酶能够更好地作用于玉米麸皮细胞壁多糖.

3)利用纤维素酶辅助木聚糖酶酶解玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖,克服了传统的利用酸解,有机溶剂提取而造成的污染,也克服了传统的单一酶解玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖效率低的缺点.

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