子宫内膜癌细胞中RNA干扰Bmi-1基因的实验研究及意义

林小满 谢 娜 徐 杨

徐州医学院附属医院妇产科，江苏徐州 221002

Bmi-1（B-cell-specific moloney murin leukemia virus insertion site 1）基因早期发现在造血及神经系统的发育过程中起重要作用，它维持干细胞的自我更新能力。近年来发现Bmi-1与肿瘤的发生关系密切，在多种肿瘤中高表达。siRNA干扰技术是目前研究癌基因作用的常用方法，为研究Bmi-1基因在子宫内膜癌发生发展中的作用，本实验在Ishikawa子宫内膜癌细胞中，运用siRNA干扰技术，检测其干扰沉默Bmi-1基因的效果，为下一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

Ishikawa细胞株（上海复祥生物科技有限公司），DMEM/F12、Opti-MEM（GIBCO公司），胰蛋白酶（南京博尔迪生物科技有限公司），RT-PCR试剂盒（Promega公司），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），Matrigel基质胶（BD公司），RT-PCR引物（上海生工生物技术有限公司合成）。Bmi-1引物序列上游为5’-TACAGAGTTCGACCTACTT-3’，下游为 5’-TGATGACCCATTTACTGA-3’，碱基对为291 bp，β-actin上游引物序列为：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物序列：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，碱基对564 bp；siRNA由上海吉玛公司设计，干扰靶序列为5’-GGTCCACTTCCATTGAAATAC-3’，质粒载体PGPU6/GFP/Neo-Bmi-1-654以及阴性对照空载体购（上海吉玛公司），全波长多功能酶标仪1500于（美国Thermo fisher公司），PCR 扩增仪 533254964（德国 eppendorf公司），分光光度计（BioPhotometer plus, Eppendorf公司），凝胶成像仪2500（Tanon公司）。

1.2 Ishikawa细胞培养

将Ishikawa 细胞株按3×105/mL的密度接种于50 mL培养瓶中，培养体系为3 mL含10%FCS的DMEM培养液，放置于37℃，5%CO2孵箱中培养，每48小时换液1次，将生长良好的细胞按1×105/mL的密度接种于6孔培养板中备转染用。

1.3 siRNA转染

24 h后观察6孔板内细胞密度达到60%，细胞状态良好，即可转染。取4个1.5 mLEP管，分为AB两组，每组2个（1号、2号）。全部EP管均加入0.25 mL opti-MEM培养基，向A组EP管中分别加入6 μL Lipofectamine2000，向B组1号EP管加入2.5 μg siRNA质粒载体PGPU6/GFP/Neo，向B组2号EP管加入2.5μg空载体作为对照，均与培养基混匀。5 min后将A组内的液体对应加入B组中，轻轻混合。B组1号EP管即为干扰组，2号EP管即为对照组，室温孵育20 min。取出六孔培养板，弃去培养液，PBS洗2次，将2个EP管中的转染液对应加入2个孔中，摇晃混匀，每孔再补加1.5 mL opti-MEM培养基，做好标记，入培养箱继续孵育，5 h后更换完全培养基。24 h后，显微镜下观察细胞荧光，镜下见约70%的细胞表达荧光蛋白，说明转染效率较高，即可用于PCR检测。

1.4 RT-PCR法检测Bmi-1干扰后mRNA的表达

按照Trizol说明书分别提取Ishikawa细胞RNA干扰组（转染48 h后）、阴性对照组的Bmi-1 mRNA。试剂剂量如下：无 核 酶 水 31μL、AMV 5×Buffer10μL、dNTPS 1μL、MgSO42μL、AMV反转录酶1μL、TflDNA聚合酶1μL、上下游引物各1μL、提取RNA 1μL。反应体系如下45℃45min、95℃预变性5 min后，以94℃变性30 s、57℃退火1 min和72℃延伸30s为1个循环，共30个循环。最后72℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分析。以上步骤重复3次。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件，RT-PCR法检测Bmi-1干扰后mRNA的电泳条带灰度比值以（± s）表示，组间比较采用 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

RT-PCR法检测Bmi-1干扰后mRNA的表达结果，Ishikawa细 胞 RNA干 扰 组Bmi-1mRNA条 带（泳 道1）灰度比为（0.115±0.011），阴性对照组（泳道2）条带灰度比为（0.287±0.014），经t检验，P ＜0.05，差异有统计学意义，提示RNA干扰Bmi-1后，其在Ishikawa细胞中的表达降低了。凝胶电泳条带见图1。

图1 Ishikawa细胞RNA干扰组、阴性对照组Bmi-1 mRNA的表达

3 讨论

Bmi-1现认为是癌基因，在人类它位于10p13，cDNA全长3 203 bp，含有10个外显子和10个内含子，其开放阅读框编码的蛋白含有326个氨基酸，相对分子质量为44 000～46 000，该基因广泛表达于多种组织中。Bmi-1属于转录抑制因子polycomb家族，可结合于基因组中的polycomb反应元件，使特定靶基因转录沉默。Bmi-1的下游靶基因是Ink4a位点，其可负性调控p16和p19的表达，进而调节细胞的增殖和衰老。目前认为，Bmi-1在造血干细胞及神经干细胞中高度表达，它维持干细胞的自我更新能力，在其发育过程中起重要作用[1-2]。Bmi-1与肿瘤的发生也关系密切，在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等肿瘤中均发现Bmi-1表达增强，并与肿瘤的恶性程度、侵袭及预后有关[3-8]。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展，由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术被广泛用于探索基因功能和恶性肿瘤的基因治疗领域。外源性dsRNA通过耗能过程降解成21～23 nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可以引发RNAi。siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。

本实验为研究bmi-1基因在子宫内膜癌发生发展中的作用，首先在Ishikawa细胞中进行了siRNA干扰实验，干扰靶序列为5’-GGTCCACTTCCATTGAAATAC-3’和质粒载体PGPU6/GFP/Neo-Bmi-1-654由上海吉玛公司设计和构建。质粒载体转染后RT-PCR法检测Bmi-1干扰后mRNA的表达，Ishikawa细胞RNA干扰组Bmi-1mRNA条带灰度比经t检验分析，差异有统计学意义（P＜0.05），提示siRNA干扰Bmi-1后，其在Ishikawa细胞中的表达降低了。本实验验证了siRNA干扰沉默Bmi-1基因技术在Ishikawa细胞中的有效性，为下一步研究奠定了基础。

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