利用大孔树脂纯化荷叶黄酮动态吸附条件的研究

安徽农业大学生命科学学院 陈佳佳 王在贵＊ 刘朝良 张 璐 方龙发

荷叶甘、平、无毒，具有消暑、清肺等作用（刘嵩，2006）。研究表明，荷叶中有效成分含量丰富，除含有碳水化合物、脂类、蛋白质等常规化学成分外，还富含具有生物活性和生理功能的黄酮类化合物（宛晓春，2003）。它是大多数氧自由基的清除剂，可以提高SOD（超氧化物歧化酶）的活力，减少脂质过氧化物丙二醛（MDA）及氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的生成（张蕾，2007；唐裕芳等，2004；余以刚等，2001），防治心血管疾病等作用（陈健芬等，2003；黄阿根等，2000）。此外荷叶黄酮还具有很强的降脂、减肥等功效，除可作为心血管疾病防治的原料药，还可广泛应用于功能性食品、保健食品和饮料中，目前已经被中华人民共和国卫生部列入药食同源的名单（陶波等，2001）。

由于荷叶黄酮具有多种功能而越来越受到广大学者的关注。大孔吸附树脂柱色谱应用于荷叶黄酮的分离纯化具有加工成本低、设备简单、节约能耗、可再生能力强等优点，为广大研究与生产厂家的首选材料（唐德智，2009；肖文军等，2007）。本试验以荷叶为原料，对几种大孔吸附树脂分离荷叶黄酮技术参数进行系统研究，获得荷叶黄酮柱分离纯化的参数，为荷叶黄酮的研究与工业化开发利用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 荷叶干品（购自合肥为民大药房 ），X6、HP-20、AB-8、HPD-100、 无 水 乙 醇 、NaOH均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 荷叶黄酮的提取 参照康璇等（2009）的方法，称取荷叶15 g，用450 mL 60%的乙醇浸泡，80℃水浴，提取3 h，过滤，滤液浓缩蒸发至200 mL，冷却，后离心得到荷叶初提物，测定其含量并用95%乙醇将其配置成3 mg/mL的标准液。

1.2.2 树脂的预处理 称取20 g湿树脂倒入烧杯，先用体积分数95%乙醇充分浸泡一夜，用乙醇洗数次至洗出液加适量水无白色浑浊，再用去离子水不断冲洗直到无酒精味且洗出液澄清，然后转入酸碱处理，即先用体积分数5%的HCl溶液浸泡3 h再用去离子水洗涤数次直到pH呈7.0左右，用5%NaOH溶液浸泡3 h，最后用去离子水洗至pH值为7.0左右。

1.2.3 荷叶黄酮的纯化

1.2.3.1 最佳吸附与解吸树脂的选择 本试验以上述荷叶黄酮标准品作为对照品测定几种大孔吸附树脂对黄酮的吸附效果。选用AB-8、HPD-100、HP-20及X-5树脂按方法1.2进行预处理。经过预处理的4种大孔树脂去表面水后，各称取2份，每份5.0 g，分2组放置于具塞磨口锥形瓶中，分别加入浓度为3.0 mg/mL的荷叶黄酮对照液40 mL，将三角瓶放在振荡器上振荡，使树脂充分吸附黄酮24 h后过滤测定滤液中荷叶黄酮的含量，吸附了黄酮的树脂加入95%乙醇40 mL，振荡充分解吸24 h，得到解吸液，测定解吸液中黄酮的含量，计算静态吸附量、解吸量与解吸率。1.2.3.2 HP-20树脂对荷叶黄酮的动态吸附效果研究 根据1.2.3.1的试验结果，选择大孔吸附树脂（HP-20）进行上样流速、上样液浓度、pH、解吸曲线以及洗脱剂的浓度动态吸附效果试验。先用缓冲液将树脂调至pH 5.0后，利用漏斗将预处理好的树脂装入玻璃层析柱（1 cm×20 cm）中，柱床体积为（BV）10.0 mL。装柱要让树脂随着缓冲液慢慢沉下，柱床紧实无气泡。利用恒流泵将黄酮提取液上柱，控制一定流速，收集所有流出液，测定其体积和浓度。

吸附量=上样液浓度 （mg/mL）×上样液体积（mL）－流出液浓度（mg/mL）×流出液体积（mL）；

使用一定体积分数的乙醇溶液进行解吸，控制一定流速，分步收集洗脱液（5 mL/管），测定每个收集管内洗脱液的总黄酮含量，计算并绘制洗脱曲线。

解吸率=洗脱液体积 （mL）×洗脱液浓度（mg/mL）/吸附量。

2 结果分析

2.1 吸附树脂的选择 按方法1.2.3.1测定4种大孔吸附树脂的静态吸附效果，结果见表1。

表1 4种大孔树脂的静态吸附效果

由表1可以看出，4种树脂中X-5树脂的吸附量最高，当原液浓度为3 mg/mL时，吸附量为48.00 mg，但其解吸量仅为 38.08 mg，解吸率为79.3%，而AB-8树脂，解吸率为95.6%，解吸率最高，但是其吸附量只有32.08 mg，故这两种树脂效果相对较差。综合比较可知，吸附与解吸效果相对较好的树脂是HP-20，尽管其解吸率较AB-8树脂低，但其吸附量较高，为45.84 mg，仅次于X-5树脂，且其解吸量在4种树脂中最高，为41.20 mg，因此选择HP-20树脂进一步做动态吸附试验研究。

2.2 HP-20树脂的动态吸附效果

2.2.1 pH值的影响 用酸或碱将荷叶总黄酮提取液调至 pH 3.62、4.24、5.40，同时将树脂调至相应pH值后再上样，测定吸附与解吸的黄酮含量，结果见表2。由表2可见，pH 4.24时，HP-20对荷叶总黄酮有较大的吸附量，故选择在弱酸或酸性条件下进行吸附。

表2 对吸附量及解吸率的影响

2.2.2 上样液浓度的影响 将荷叶总黄酮的浓缩液加水分别稀释成0.30、0.50 mg/mL和 0.70 mg/mL 3种浓度后分别上样。结果见表2。表2表明，上样液浓度较低时，吸附量较小，随浓度的增大，吸附量也增大，当上样液浓度达到0.70 mg/mL时，吸附量增加不明显，上样液浓度控制在0.50～0.70 mg/mL较合适。

2.2.3 流速的影响 利用恒流泵控制流速，分别以 0.70、1.50、2.3、3.1 mL/min 进行上样。 结果见表2。表2表明，当流速加到2.3 mL/min时，树脂的吸附量明显下降，流速过慢时，虽然吸附量增加，但导致循环周期延长。因此，控制在1.50 mL/min较理想。

2.2.4 洗脱剂体积分数的选择 以不同体积分数的乙醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，每次收集40 mL的洗脱液，将洗脱液混匀后测得其中的总黄酮含量，结果见表2。从表2可以看出，乙醇体积分数越高，洗脱效果越好，当用体积分数达到80%以上的乙醇水溶液洗脱时，已经可以有很好的洗脱效果。

2.2.5 HP-20树脂的解吸曲线 准确称取荷叶黄酮对照品配成1.0 mg/mL的溶液，10 mL树脂处理25 mL（1.0 mg/mL）的料液，流速1.5 mL/min上样，吸附后用蒸馏水洗后，再分别 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 BV 的 95%乙醇溶液洗脱， 测定每个流出液所洗脱下来的荷叶黄酮的含量，以洗脱液总体积对洗脱下来的荷叶黄酮的总量作洗脱曲线。结果见图1，随着乙醇洗脱体积的上升，黄酮的解吸量增加，当洗脱体积小于2.5 BV时，洗脱量与洗脱体积呈正相关关系，当洗脱体积大于3 BV时，洗脱体积对洗脱量基本无影响，从节约成本的角度出发，使用3 BV的洗脱液即可将荷叶黄酮较大部分洗脱下来。

图1 HP-20树脂的洗脱曲线

3 小结

通过以上试验，得到了大孔吸附树脂HP-20对荷叶总黄酮的最佳吸附条件是提取液总黄酮含量为0.50～0.70 mg/mL，上样流速为1.5 mL/min，提取原液最适pH为4.3左右，这是由于总黄酮化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，因而可达到较好的吸附效果。在这些条件下，树脂对荷叶总黄酮的吸附量可以达到5.20 mg/mL，通过使用不同体积分数的乙醇进行洗脱，发现体积分数越高的乙醇水溶液洗脱效果越好，当用体积分数达到80%的乙醇水溶液洗脱时，解吸率已经达到了89.9%，洗脱效果已经相对较好。大孔树脂HP-20具有物理化学稳定性，对荷叶总黄酮吸附选择性强，富集效果好，解吸条件温和，且HP-20再生简便，使用周期长，是一种理想的富集纯化荷叶总黄酮的主材料。

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