大黄炮制后化学组分转移规律研究

李会芳，孙 琴，王伽伯，金 城，肖小河

（1.山西中医学院，山西 太原 030024； 2.泸州医学院，四川 泸州 646100；3.解放军第三○二医院全军中药研究所，北京 100039）

大黄为常用中药，具有泻下攻积、清热泻火、解毒、活血化瘀的功效。大黄炮制规格有多种，《中国药典》收载有大黄、酒大黄、熟大黄及大黄炭等4种［1］。现一般公认大黄的不同炮制品药性差异明显，临床应用中多根据病证及病情的轻重缓急和适用人群的不同而使用不同的炮制品。因此研究大黄炮制前后化学组分的变化规律，可反映不同炮制品的内在品质，对于临床合理选择大黄的不同炮制品具有重要的意义。

1 实验材料

1.1 实验仪器

超高效液相色谱仪（Waters Acquity，美国），配有二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱及二极管阵列检测器（PDA），Empower 2色谱工作站，Waters Ac quity BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），微量分析天平（MettLer ToLedo AL204瑞士）等。HP8452A型分光光度计为美国安捷伦公司产品。

1.2 药品与试剂

实验用药材大黄20 kg购自甘肃礼县药材公司，经解放军第三○二医院全军中药研究所肖小河研究员鉴定为蓼科植物掌叶大黄Rheum paLmatum L.的干燥根。委托北京仟草中药饮片有限公司（GMP证书编号G3256）依据北京市中药饮片炮制规范2006年版进行炮制加工，分别得到酒大黄、熟大黄、大黄炭各5批。对照品：大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚（中国药品生物制品检定所，批号分别为 110756－200110、110796－200310、0757－200206、110795-200504、110758-200509）；没食子酸（中国药品生物制品检定所，批号为110831-200302）。甲醇为色谱纯，水为纯净水，使用前均经0.45 μm滤膜滤过；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 比色法测定总鞣质成分含量［2］

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品25 mg置50 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5 mL，置25 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得（每1 mL中含没食子酸0.05 mg）。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 分别置于25 mL棕色量瓶中，各加磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水 11.5 mL、11 mL、10 mL、9 mL、8 mL、7 mL，用 29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白用酶标仪在560 nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。数据经回归处理，得回归方程：C（mg/mL）=69.225A-0.044 3，r=0.998 1；表明没食子酸在0.001 mg/mL～0.01 mg/mL浓度范围内与吸光度有较好的线性关系。

2.1.3 供试品溶液的制备 大黄粉末适量，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加水30 mL，放置过夜；超声处理10 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀静置，过滤，弃去10 mL初滤液，精密量取续滤液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 样品中鞣质含量测定 总酚量：精密量取供试品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1 mL起，加水10 mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。不被吸附的多酚取供试品溶液12.5 mL，加至已盛有干酪素0.3 g的50 mL具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1 h，取出，放冷，摇匀，滤过；弃去初滤液，精密量取续滤液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1 mL起，加水10 mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。按下式计算鞣质的含量。

鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量

2.2 UPLC测定5种蒽醌成分含量

《中国药典》（2010年版）一部大黄项下收载的含量测定方法为高效液相法（HPLC），为蒽醌类成分含量测定的经典方法。本文在此基础上，建立了基于超高效液相色谱法（UPLC）同时测定5种蒽醌的方法，样品的分离速度提高了 8倍［3］。

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取大黄素等5种对照品适量，置于同一量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得到含大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚各40 μg/mL的混合对照品溶液作为储备液。该储备液在4℃避光冷藏可稳定保存2个月以上，将此储备液适当稀释成含各成分4 μg/mL的溶液作为对照品工作液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取大黄样品粉末适量，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加入回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得。

2.2.3 色谱条件及测定法 Waters Acquity BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流速 0.75 mL/min，检测波长 254 nm，进样量 1 μL，柱温 35 ℃，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（69∶31）为流动相。理论板数按大黄素峰计算应不低于2 000。

2.2.4 实验结果 大黄样品的典型色谱图见图1，对比图中（A）和（B），可以看出UPLC方法较传统的HPLC方法节约分析时间8倍以上。大黄不同炮制品蒽醌含量测定结果见表1，图2。从表1、图2可以看出，大黄炮制前后多组分化学含量发生了明显的变化，其中游离蒽醌含量：熟大黄>酒大黄>生大黄>大黄炭；结合蒽醌含量：生大黄>酒大黄>熟大黄>大黄炭；鞣质含量：生大黄>酒大黄>熟大黄>大黄炭。

各化学组分变化规律如下：①游离蒽醌，酒炒后（酒大黄）增加34.88%，经酒蒸（熟大黄）后增加70.73%，而炒炭（大黄炭）后损失33.66%。②结合蒽醌，酒炒后减少7.80%，经酒蒸后减少59.07%，而炒炭后损失94.71%。③总蒽醌，酒炒后减少3.86%，经酒蒸后减少47.55%，而炒炭后损失89.09%。④鞣质，酒炒后减少9.39%，经酒蒸后减少85.56%，而炒炭后损失90.64%。

表1 大黄炮制前后多组分成分含量变化表 （‰）

图1 大黄不同炮制样品UPLC图

图2 大黄炮制前后多组分含量变化图

3 讨 论

大黄炮制过程中主要对结合蒽醌的含量产生了明显的影响，结合蒽醌含量减少。结合蒽醌经过分解，转变为游离蒽醌。大黄炮制过程中，每一种结合蒽醌含量的降低变化趋势与结合蒽醌的总量变化趋势基本一致，但游离蒽醌的含量增加与游离蒽醌含量增加的程度不同。其中以大黄酚和大黄素的含量增加最明显，其次为芦荟大黄素、大黄酸，而大黄素甲醚略降。

大黄经炮制后不仅是以前认为的苷类水解及所含成分平行下降，而且发生了复杂的化学变化，原药材中成分比例重新组合，从而导致疗效、药性发生变化。

生大黄中游离蒽醌与结合蒽醌的比例为1∶9.8，酒大黄为 1∶6.7，熟大黄为 1∶2.4，大黄炭为 1∶0.8，随炮制强烈程度游离蒽醌的比例逐渐增加。

大黄炮制前后蒽醌类成分的组成和含量发生了变化，与炮制条件的强烈程度有关。生大黄、酒大黄中总蒽醌的含量相差不大，熟大黄和大黄炭的总蒽醌含量下降，尤以大黄炭中总蒽醌的含量显著减少。这可能是因为炒炭的方法条件剧烈，大黄中各成分破坏严重，蒽醌类成分受到很大程度的破坏。而熟大黄由于受热时间较久，总蒽醌的成分也受到了一定程度的破坏，结合蒽醌较多地分解为游离蒽醌，游离蒽醌的含量高于生大黄和酒大黄。酒大黄中化学成分相对破坏较轻，蒽醌类成分在结合型与游离型之间转化，所以总量变化较小。蒽醌类成分含量差异也提示了大黄的不同炮制品之间存在着药效与毒性的差异。

大黄不同炮制品的鞣质含量也与炮制的条件有关。鞣质的含量以生大黄最高，炮制受热后都不同程度地有所降低，大黄炭中最低，甚至检测不到，这可能与鞣质含量比色检测方法专属性较差有关。现代药理研究已经证实鞣质中d-儿茶素和没食子酸是大黄止血的有效成分，根据本实验的结果生大黄的鞣质含量最高，止血效果应好于大黄炭及其他炮制品。这与传统认为大黄炭的止血作用最强相悖，应进一步深入研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2010：22.

［2］王伽伯，肖天资，赵艳玲，等.分光光度法与吸附质量法测定大黄鞣质含量的对比研究［J］.中国新药杂志，2009，18（14）：1 369-1 371.

［3］Wang Jiabo，Li Huifang，Jin Cheng，et al.Development and validation of a UPLC method for quality control of rhubarb-based medicine：Fast simultaneous determination of five anthraquinone derivatives［J］.J Pharm Biom Anal，2008，47（4/5）：765.