HPLC测定银翘解毒片中连翘苷的含量

朱旭峰

（山西省阳泉市第三人民医院，山西 阳泉 045000）

银翘解毒片是由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草组成。其为淡棕色至棕褐色的片或薄膜衣片，除去包衣后显棕色至棕褐色；气芳香，味苦辛，具有疏风解表、清热解毒的功效；用于风热感冒，症见发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛等。其主药连翘的主要生物活性成分连翘苷具有较强的抗菌作用，并能抑制cAMP磷酸二酯酶的活性，故可以用作指标成分进行含量测定［1］。为更好地控制其质量，保证该制剂的临床疗效，本研究建立了银翘解毒片中有效成分连翘苷含量的高效液相色谱测定法，该法简便、准确、重复性好，为银翘解毒片的质量控制提供了科学依据。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

银翘解毒片为山西振东开元制药有限公司生产，生产批号：20100904；乙腈为色谱纯溶剂，天津市永大化学试剂开发中心生产；水为实验超纯水；乙醇、甲醇均为天津威晨化学试剂科贸有限公司生产；中性氧化铝由上海五四化学试剂厂提供，试剂均为分析纯。连翘苷含量测定对照品，由中国药品生物制品检定所提供，批号：110821-200609。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪：SSI Model 500-detector单元液相色谱仪，PC-3000系统检测仪，TL-9900色谱工作站，柱温箱，手动进样器。AUW220D电子天平，KQ-300E型超声处理器（功率250 W，频率33 kHz），XYD-10-H实验室专用纯水机。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）十八烷基键合硅胶为填充剂；乙腈-水（25∶75）为流动相；检测波长277 nm；流速1 mL/min；柱温20℃。理论塔板数按连翘苷的峰面积计算不得低于2 500，进样体积10 μL。在此条件下连翘苷色谱峰峰形对称，供试品色谱图中连翘苷能与其他成分很好分离。

2.2 对照品溶液的制备［2］

精密称取连翘苷对照品5 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。使连翘苷制成每1 mL甲醇含50 μg的溶液作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备［2］

取银翘解毒片20片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取约5片量的细粉置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，浸渍过夜。超声处理25 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量。摇匀，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液15 mL，蒸至近干，加中性氧化铝1.5 g拌匀，加至中性氧化铝柱上（100目～120目，1 g，内径 1 cm～1.5 cm），用 70%的乙醇120 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，并用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液为供试品溶液。

2.4 样品含量测定

吸取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪中，按外标法以峰面积计算其含量，结果见表1。计算公式为：

表1 样品含量测定结果

2.5 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液 2 μL、6 μL、10 μL、14 μL、20 μL，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，峰面积分别为1 071 229、3 213 794、5 356 153、7 498 547、10 713 971。按色谱条件测得峰面积积分值，以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程Y=107 139X-475.8，相关系数r=0.999 1，表明连翘苷在10 μg/mL～100 μg/mL之间线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，记录峰面积，结果分别为5 241 340，5 497 239，5 371 493，5 296 280，5 374 372。RSD=1.80%，结果表明仪器进样精密度良好。

2.7 重复性试验

按供试品溶液制备方法制备5份，精密吸取供试品溶液10 μL，测定含量。结果分别为0.557 mg/片、0.558 mg/片、0.549 mg/片、0.561 mg/片、0.556 mg/片，平均含量为0.556 mg/片，RSD为0.80%。结果表明，本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取供试样品溶液分别在 0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h进样10 μL，测得连翘苷的峰面积分别为8 985 475、8 975 308、8 975 464、8 875 395、8 862 746、8 918 237，RSD为0.60%。表明供试品溶液在室温下24 h内基本稳定。

2.9 加样回收率试验

取样品（2号样品，批号：071208）相当于一片重量的粉末，精密称定，精密加入连翘苷对照品溶液10 mL，按供试品制备方法制备样品，测定总量、回收率，结果见表2。

表2 加样回收实验测定结果

3 讨 论

流动相中乙腈比例微小的变化会明显影响连翘苷的保留时间，实验表明，乙腈-水比例为25∶75时，保留时间较适宜且连翘苷峰形对称、分离完全。

本方法供试品溶液制备方法简便易行，在该色谱条件下连翘苷峰分离效果良好，回收率符合要求，结果理想。本品采用中性氧化铝柱洗脱的方法除去杂质，把对设备的损害尽可能降到最低程度。根据对流速的考察，发现当流速为1.0 mL/min的时候，连翘苷分离效果更好，出峰时间更适中。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：117-118.

［2］国家药典委员会.中国药典高效液相色谱图集［M］.北京：人民卫生出版社，2005：592.