从酸枣仁中分离酸枣仁皂苷B并测定其含量*

王婷宇

(天津医科大学总医院，天津 300052)

酸枣仁为鼠李科(Rhamnaceae)植物酸枣[ZizphusjujubaMill var spinosus(Bunge) Hu ex H F Chou]的干燥成熟种子[1]。其味甘、酸，归肝、胆、心经，主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口湿等症。现代研究表明：酸枣仁具有镇静催眠、镇痛、抗惊厥、降血脂、抗血小板聚集、增强免疫功能、降压、抗缺氧、抗心肌缺血、抗心律失常、抗衰老和抗辐射作用[2]。酸枣仁总皂苷(主要为酸枣仁皂苷A和B)为其主要化学成分之一，具有显著的镇静催眠活性[3]。为了进一步研究其应用价值，本实验用多种色谱分离技术，对酸枣仁总皂苷中的酸枣仁皂苷B进行了分离，并通过波谱学手段来确定其结构，并测定其含量。

1 材料

1.1仪器 X-4型熔点测定仪；Brucher AV 400型核磁共振波谱仪；ESI-MS用QUATTROTM API型仪器测定；FREEZONE 4.5型Labconc冻干机；Water 515型液相色谱仪；Alltech 2000型蒸发光散射检测器。

1.2试药 柱层析硅胶(200-300目，00300，青岛海洋化工厂)；硅胶(80-100目，040815，青岛海洋化工厂)；硅胶G预制板(040725，青岛海洋化工厂)；反相硅胶板(040913，Merck公司)；反相硅胶材料(50μm, C18，5409，三菱重工)；大孔树脂(D-101,040823，天津市南开化工厂);实验用水为自制重蒸水;甲醇(色谱纯)为天津康科德科技有限公司产；其他试剂为天津康科德科技有限公司产分析纯；硅胶薄层板显色剂为：浓硫酸-香草醛(120 ℃加热)。酸枣仁11 kg，(亳州饮片厂)，对照品酸枣仁皂苷B(成都思科华生物技术有限公司)。

2 方法

2.1总皂苷的提取 称取酸枣仁药材11 kg,粉碎后加8 L 70%乙醇热提取3次，回流提取液，浓缩至无醇味，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压回收正丁醇部分至干，得干品252 g。取2 kg大孔树脂，以纯水湿法装柱。用水500 ml混溶回收所得干品(252 g)，直接湿法上柱。常压下用50%乙醇洗脱3BV(一个BV约为4 L)，得总黄酮部分。常压下再用80%乙醇洗脱3BV，回收试剂得总皂苷部分10.14 g。

2.2酸枣仁皂苷B的分离和纯化 总皂苷部分反复经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水进行梯度洗脱。洗脱液以酸枣仁皂苷B为对照品作TLC(氯仿-甲醇-水=7∶3∶0.5，取下层，硫酸-香草醛显色)检查，合并斑点与酸枣仁皂苷B对照品Rf值一致的流分，得到粗品800 mg。 以反相硅胶(50 μm,C18)进一步纯化所得粗品，以甲醇-水进行梯度洗脱。洗脱液以酸枣仁皂苷B为对照品作RP-TLC(70%甲醇展开，254 nm下观察暗斑)检查流分，合并斑点与酸枣仁皂苷B对照品Rf值一致的流分。50 ℃下，减压回收溶剂，水液直接冻干，得化合物Ⅰ纯品500 mg。酸枣仁提取、分离和纯化流程见图1。

图1 酸枣仁提取、分离和纯化流程

2.3结构鉴定 化合物Ⅰ，白色粉末，mp 228～232 ℃,ESI-MS m/z1067[M++Na]。13CNMR数据见表1。

由表1可得：化合物Ⅰ的质谱数据和碳谱数据与文献[4]中酸枣仁皂苷B 的数据一致。故所得化合物Ⅰ为酸枣仁皂苷B。

化合物Ⅰ的1HNMR(C5D5N)数据为：0.63,1.08,1.08,1.14,1.38,1.70(3H each,all s,19,18,29,28,21,26-H3),1.56(3H,dd-like,3-H),1.62(3H,d,J=6.0Hz,Rha-6’’-H3),2.81(1H,m,13-H),3.15(1H,dd-like,3-H),4.87(1H,d-like,Ara-1’-H),5.11(1H,d,J=7.6Hz,Glc-1’’’-H),5.36(1H,d,J=7.2Hz,Xyl-1’’’’-H),5.96(1H,brs,Rha-1’’-H)。化合物Ⅰ的1HNMR 谱数据更进一步证实了化合物Ⅰ为酸枣仁皂苷B。结构见图2。

2.5ELSD法测定所得酸枣仁皂苷B的纯度

2.5.1色谱条件 色谱柱：Alltech C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水-甲酸(70∶30∶0.1)；流速：1.0 ml/min；ELSD气化室温度：105 ℃；氮气流量：2.5 L/min；柱温：40 ℃[4]。

2.5.2溶液的制备

2.5.2.1对照品溶液的制备 称取对照品酸枣仁皂苷B 10.002 mg，甲醇溶解，定容至10 ml量瓶，摇匀，即得浓度为1.002 mg/ml对照品。临用前取部分溶液经滤膜(0.45 μm)过滤后进样10 μl。色谱图见图3。

2.5.2.2供试品溶液的制备 称取自制酸枣仁皂苷B10.013 mg，甲醇溶解，并定容至10 ml量瓶，摇匀，即得浓度为1.013 mg/ml样品溶液。临用前取部分溶液经滤膜(0.45 μm)过滤后进样10 μl。色谱图见图3。

表1 化合物Ⅰ的碳谱数据(吡啶)

2.5.3纯度测定 通过质谱、碳谱和氢谱数据的综合分析，并与相关文献[4]比较，得出化合物Ⅰ为酸枣仁皂苷B，且其纯度大于98.2%，达到了纯化的目的。

图2 化合物I的化学结构

1.酸枣仁皂苷B

3 讨论

3.1实验中发现，酸枣仁总黄酮与总皂苷部分直接用硅胶柱分离，其分离效果不理想，而用D-101树脂可将二者很好的分离开。总黄酮与总皂苷部分可分别由50%和80%乙醇洗脱下来，故实验中采用此法除去总黄酮而得到总皂苷部分。

3.2反相硅胶对皂苷分离一般较有优势，故皂苷B的精制过程中使用了反相材料。从本实验反相硅胶柱的分离情况看，基本达到了进一步分离酸枣仁皂苷B的目的。

3.3实验中测定的13CNMR数据均略高于文献[4]数据，可能是由于做13CNMR测定时，调整的内标有移动。

3.4酸枣仁中所含有的酸枣仁皂苷B为三萜皂苷类成分，紫外吸收差，不宜用UV检测器。而ELSD检测器为质量型通用检测器，可检测任何挥发性低于流动相的化合物，且化合物的响应值接近，因而峰面积比例亦近乎各组分的质量之比。同时灵敏度及稳定性亦能符合含量测定的要求，正逐步成为分析无紫外吸收类成分的有力工具[6]。

1 中国药典.一部.2000:300-301

2 梅全喜，毕焕新.现代中药药理手册.北京：中国中医药出版社，1998：478

3 Watanabd I,Satio H,Takgi K.Pharmacological studies of zizyphus seeds.Japan J Pharmacol,1973,23(4):563

4 王锋,刘雪松,陈勇,等.酸枣仁皂苷大孔树脂纯化工艺及HPLC-ELSD测定方法研究.中药材，2010,33(8):1342

5 曾路，张如意，王序.药学学报.酸枣仁化学成分研究Ⅱ.1987，22(2)：114

6 田南卉，王颉，厉进忠.高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定银杏叶提取物中内酯的含量.药物分析杂志，1997，17(4)：282