蒙药升阳十一味丸对三种人消化系肿瘤细胞的增殖抑制作用

邓秀玲 王 栋 刘淑萍

1.内蒙古医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古 呼和浩特 010059;2.内蒙古自治区医院神经内科，内蒙古 呼和浩特 010017

恶性肿瘤严重威胁着人们的生命，人体的实体肿瘤60%都发生在消化道，我国更是消化道肿瘤高发国家，平均每小时就有120个中国人罹患消化道肿瘤。肿瘤的发生、发展与细胞异常增殖和分化有关，如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力，是肿瘤治疗的一个基本问题 。本文研究蒙药升阳十一味丸对体外培养的人三种消化系肿瘤细胞生长的影响，为寻找高效、低毒的抗癌新药提供一些实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 培养基DMEM、1640为Gibco公司产品，胎牛血清为中国医学科学院血液学研究所生产，噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜 (DMSO)均为Sigama公司产品。蒙药升阳十一味丸 (以下简称十一味丸)由内蒙古中蒙医院制剂室生产，用PBS配成50mg/ml贮液，0.2mm滤膜过滤除菌4℃保存，实验时用培养液稀释到所需浓度。

1.2 细胞培养和实验分组 MGC－803细胞由北京肿瘤研究所提供，于含庆大霉素80u/ml、10%灭活胎牛血清的DMEM的培养液中培养，结肠癌LoVo(购自天津肿瘤医院)、胰腺癌细PC－3(购自中国医学科学院细胞研究所)，于含10%胎牛血清的1640培养基中培养，置37℃、5%CO2温箱中孵育，取对数生长期细胞用于实验。实验分为四组:阴性对照组 (只含肿瘤细胞，不加药组)、阳性对照组 (紫杉醇处理组)、实验组 (不同药物浓度处理组)和空白对照组 (只含培养基，不含细胞和药)。

1.3 十一味丸对三种癌细胞的增殖抑制作用 采用MTT法［1］。取对数生长期的三种细胞，经消化液消化后制成单细胞悬液，台盘蓝计数后，调整细胞数接种96孔板，胃癌MGC－803细胞以3×104个/ml、结肠癌LoVo细胞以2×104个/ml、胰腺癌PC－3细胞以5×104个/ml接种，每孔100ul，置37℃、5%CO2温箱孵育24h。每孔再加含药培养基100ul，结肠癌和胰腺癌设五个不同浓度处理组，至药物终浓度分别为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.15mg/ml。胃癌设6个不同浓度处理组分别为:2.5mg/ml、 2.0mg/m1、 0.25mg/ml、 0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.15mg/ml。另设阴性对照组 (只有细胞，不加药)和空白组 (只含等量培养基)，及紫杉醇阳性对照组，作用浓度为10－6mol/L，每组均为8个复孔。继续培养72h，每孔加20ulMTT(5 mg/ml)，37℃孵育4h，1500r/min离心10min，弃上清，每孔加200ulDMSO，恒温振荡器振荡10min，使结晶物溶解。选择570nm波长，酶标仪上检测各复孔吸光度 (A值)。进行数据统计时，每组去除一个最大值和最小值，按下列公式计算细胞生长抑制率。

抑制率 (%)=(对照组A值－实验组A值)/(对照组A值－空白组A值)×100%

1.4 三种细胞的形态变化观察 MGC－803细胞、LOVO、PC－3细胞经消化液消化后，台盘蓝计数以6×105个/ml接种75ml培养瓶中，培养24h，更换培养液，MGC－803对照组细胞用DMEM继续培养，LOVO和PC－3细胞对照组用1640继续培养;实验组细胞加入含不同浓度十一味丸(2.5mg/ml、2.0mg/ml 、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml)的培养基，于培养后每6h观察细胞形态变化并作照相记录。

2 结果

2.1 十一味丸对三种癌细胞的增殖抑制作用 从表1、2、3可见，十一味丸可明显的抑制胃癌MGC－803细胞、结肠癌LoVo和胰腺癌PC－3细胞的生长，实验组吸光度与对照组比较有显著性差异 (P＜0.05)，表现出很强的细胞毒作用。其 IC50分别为:1.57mg/ml、0.66mg/ml、0.91mg/ml。高浓度 (2.5mg/ml)对胰腺癌、胃癌细胞所表现的增殖抑制作用，与阳性对照组紫杉醇处理组相比不具有统计学意义 (P＞0.05)，表明该药在体外对这两种细胞的增殖抑制作用与紫杉醇相当。

表1 十一味丸对胃癌MGC－803细胞的增殖抑制作用

表2 十一味丸对结肠癌LoVo细胞的抑制作用

表3 十一味丸对胰腺癌细胞的增殖抑制作用

2.2 细胞形态学观察 倒置光学显微镜下，胃癌MGC－803对照组细胞呈不规则多角形生长，细胞均质而透明 ，核大居中，核仁明显，生长旺盛。2.5mg/ml十一味处理MGC－803细胞后形态较对照组发生了明显改变。处理12h既有少数细胞开始变圆，细胞皱缩，24h后部分细胞已变圆，与周围细胞脱离，体积变小，胞浆颗粒增多，细胞表面变得粗糙，出现“吐泡”现象，有些形似梅花状改变，细胞数目减少。随着作用时间的延长，贴壁细胞逐渐减少，呈“梅花状”的细胞逐渐增多，为典型凋亡细胞的形态改变，有少量细胞脱落而悬浮于培养液中。正常培养的结肠癌LOVO细胞呈上皮样贴壁生长，胞体较大;经该药2.5mg/ml处理12h的LOVO细胞形态改变不明显，细胞生长相对缓慢，至48h大部分细胞变圆，细胞周围分泌物增加。胰腺癌PC－3细胞经该药2.5mg/ml处理后细胞生长缓慢，胞质粗糙，细胞折光性下降。随着作用时间的延长，细胞数目减少，不规则形状的细胞增多，最后破碎坏死 。而对照组细胞呈类圆形贴壁生长，生长良好。

3 讨论

蒙医药作为传统民族医学的一部分，具有显著的民族和地域特色，理论独特，蒙药多用成药且剂量小，具有高效、低毒发挥复合药理作用、疗效可靠等特点，已成为当今抗肿瘤药物或免疫调节药物等新药开发的研究热点之一［2］。

升阳十一味丸是由黄精、玉竹、天花粉、藜蒺等十一味单方组成的复方蒙药，临床上用于治疗胃寒、消化不良、寒性腹泻等症。组方中有许多单方具有抗肿瘤的药理作用［3，4，5］，但单方不能反映复方蒙药的药理作用及蒙医学的理论体系，况且蒙医学对消化系肿瘤又有自己独特的认识与治疗方法［6］。本实验采用人们较为推崇的体外药物敏感性实验－MTT法，观察十一味丸对胃癌、结肠癌、胰腺癌细胞增殖的影响。结果表明，该药能显著抑制体外培养的三种消化系肿瘤细胞的生长 (P＜0.05)，计算其IC50值分别为:1.57mg/ml、0.66mg/ml、0.91mg/ml，且抑制作用随药物浓度的增加而增强，表现出良好的量效关系。实验中发现随着作用时间的增加其抑制作用也在增强。经该药作用后三种细胞最高抑制率＞50%，表明该药对这三种细胞系均敏感。当药物浓度＞0.63mg/ml，该药可抑制胃癌、结肠癌、胰腺癌细胞的增殖或引起细胞死亡;当药物浓度较低时，三种细胞生长抑制率＜30%，表明该浓度下对细胞的增殖抑制作用不理想。不同癌细胞接受同一种药物作用的能力是有差别的，本实验中，在同一浓度范围内十一味丸对胃癌细胞、结肠癌细胞的增殖抑制作用较强，与紫杉醇的抑制作用相当 (P＞0.05)，最高抑制率达80%以上;而对胰腺癌的作用相对较弱。十一味丸抑制三种消化系肿瘤细胞增殖，表现出浓度、时间依赖性，这与某些中药复方抗癌作用效果的报道相一致［7，8，9，10］。实验中发现同一种药物引起不同细胞增殖抑制的作用方式也有所不同，十一味丸作用于胃癌细胞后出现凋亡细胞的形态改变;而结肠癌、胰腺癌细胞经十一味丸处理后的形态改变趋向坏死。同时在本实验中发现，低浓度 (＜1.25mg/ml)药物处理后细胞生长缓慢，但早期形态改变不明显。这一结果可为临床应用蒙药治疗消化道肿瘤提供一定的理论参考价值。本文对该蒙药抑制三种消化系肿瘤细胞的增殖只做了初步探讨，具体的作用机制还需深入研究，从而为抗癌蒙药进一步应用提供一些新思路。

［1］李翠玲，崔正言，李淑贞.MTT比色法的改良及初步应用［J］.上海免疫学杂志.1996;16(5):306.

［2］松林，乌云斯日古楞.试论中国蒙药的研究概况［J］.中国民族医药杂志，2006;2(1):26－29.

［3］张瑞宇.中药黄精的研究和开发利用途径［J］.渝州大学学报 (自然科学版).2002;19(4):6－7.

［4］王英俊.天花粉蛋白对胃癌细胞株SGC－7901凋亡影响的体外研究［J］.中国医药导报.2007;4(16):130－131.

［5］张岚，杜亚明，王中彬..玉竹提取物B对人食管癌细胞Eca－109增殖与凋亡的影响［J］.山东医药.2010;50(18):3－4.

［6］赛西娅，乌力吉特古斯.蒙医学对消化系统肿瘤的认识［J］.中国民族医药杂志，2000;12(6):9－10.

［7］候波，裴锐铮，韩雪梅.槲皮素对人结肠癌细胞体外增殖、细胞凋亡及细胞周期的影响［J］.中国实验诊断医学，2009;12(13):1686－1688.

［8］陈必新，唐万和，王扬，等.央芪汤对胃癌凋亡的实验研究［J］.现代中西结合杂志，2010;19(3):272－274.

［9］金秀东，张承玉.复方五味子素B抑制人胃癌细胞株增殖的机制研究［J］.中药新药与临床药理，2008;19(4):262－265.

［10］浦红琴，韦星，李朝改，等.中药抗癌灵诱导人肝癌SMMC－7721细胞凋亡及其机制研究［J］.中国老年学杂志，2009;29(3):228－290.