一氧化氮与胃黏膜细胞凋亡的关系

张晓君 王爱鱼 丁瑞峰

(包头医学院第一附属医院消化科 内蒙古包头 014010)

细胞凋亡对多细胞有机体的发育、内环境的稳定致关重要,他的异常与肿瘤发生密不可分。近年发现胃癌中不仅存在细胞增生,同时也存在细胞凋亡,胃癌的发生是细胞凋亡与增生比例失调的结果。大量研究证明NO既有细胞保护作用,亦有细胞损伤作用。NO在胃癌的发生和发展中可能起到一定作用,但是,在胃癌的发生发展过程中NO水平及胃黏膜细胞凋亡的关系如何有待于进一步证实。为此,本实验通过检测NO在慢性胃病血清中的含量及观察胃黏膜组织细胞凋亡的情况来探讨NO含量与胃黏膜细胞凋亡的关系,为阐述NO在胃癌中的作用提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 观察对象

于2008年8至月2009年10月在本院胃镜室就诊的慢性胃病及胃癌患者132例,胃镜下显示为慢性胃炎和胃癌患者于其病变处取3块活检,1块用AF液固定(备用做切片观察细胞凋亡),2块送病理做病理分型,评定结果采用悉尼分类法。胃镜取材后随即抽取患者血液2mL,离心收集血清0.5mL置于-20℃冰箱中备用。经病理诊断为慢性浅表性胃炎为40例,萎缩性胃炎(含肠化生、异型增生)60例,胃癌32例,男性88例,女性44例,年龄17～73岁,平均年龄(53.9±12.4)岁。

1.3 方法

1.3.1 NO含量的检测 采用亚硝基还原法检测NO的含量,一氧化氮试剂盒由南京建成生物技术有限公司提供,操作程序严格按试剂说明书进行,根据公式计算NO含量。

1.3.2 凋亡细胞数的检测 采用荧光染色法检测细胞凋亡数,Hoechst染色试剂盒由江苏碧云天生物技术有限公司提供。常规石蜡包埋,切片,贴片与烤片,脱蜡与水化后PBS液洗两遍,每次3min,加入0.5mL Hoechst33258荧光染色液,染色5min,再去染色液:用PBS液洗两遍,每次3min,然后滴一滴抗淬灭封片液,盖上洁净的盖玻片,尽量避免气泡。用激发波长350nm左右的荧光滤片,可检测到致密浓染的蓝色细胞核。每张切片用40×10的物镜至少连续观察5个视野,每个视野计数100个上皮细胞中的凋亡细胞数,以平均数为凋亡指数(AI)。

表1 不同病变组NO检测值与细胞凋亡情况的比较(±s)

表1 不同病变组NO检测值与细胞凋亡情况的比较(±s)

注:与浅表性胃炎比较,*P<0.01,#P>0.05

例数 NO(umol/L)AI(%）浅表性胃炎萎缩性胃炎胃 癌40 60 32 66.74±19.25(80.31±16.31)*(95.81±13.82)*5.29±1.65(8.45±1.78)*(4.71±1.36)#

1.4 数据处理

2 结果

浅表性胃炎组,萎缩组,胃癌组血清NO含量分别为(66.74±19.25)umol/L,(80.31±16.31)umol/L,(95.81±13.82)umol/L浅表组＞萎缩组＞胃癌组(P<0.01);浅表性胃炎组,萎缩组,胃癌组胃粘膜凋亡指数(AI)分别为(5.29±1.65),(8.45±1.78),(4.71±1.36)萎缩组＞浅表组(P<0.01),胃癌组与浅表组比较无统计学意义(P>0.05),结果见表1。

3 讨论

胃癌严重影响着患者的健康和生命,迄今为止,人们对胃癌的认识仍然有限,虽然已经有很多肿瘤标志物方面的研究,但是仍然没有全面揭开肿瘤之谜。研究发现NO在肿瘤的发展方面具有重要作用,对NO的研究可能揭开胃癌研究的新领域。

大量的研究和实验发现由NO引起的凋亡在许多不同种类的鼠和人的细胞中都可被观察到。通过观察发现,由NO引发的细胞凋亡途径类似于在依赖线粒体凋亡途径中已查明的信号通路,但前者更强调凋亡执行过程中作为NO目的分子的肿瘤抑制因子p53的作用。实验表明p53在NO调控细胞周期调节因子或凋亡蛋白(如p21或Bax)的过程中是不可或缺的。NO引发的凋亡其启动方式在不同生物的细胞中是有所不同的,在通常情况下,NO是通过线粒体介导的途径引起细胞凋亡的[1]。另一方面,巨噬细胞等在激活或某些病理条件下大量合成释放NO发挥细胞毒作用。NO氧化生成终末代谢产物为NO3和NO2等,它们比NO更活泼,细胞毒性更大,可氧化DNA,造成链断裂,交叉联结和碱基修饰等多种DNA损害,从而诱发细胞凋亡[2]。

本研究结果显示,NO的含量在各病变组为:胃癌组>萎缩(肠化,异型增生)组>慢性浅表胃炎组(P<0.01),慢性萎缩性(肠化生,异型增生)组的AI值均大于慢性浅表性胃炎组(P<0.01),而胃癌的AI值与慢性浅表性胃炎的比较无明显差异(P>0.05),这与晏楠[3],李子俊[4],尹春华等[5]研究结果相似。该结果提示NO可能与胃癌前病变的关系密切。细胞凋亡的增加一则可导致胃黏膜的萎缩,萎缩性胃炎的形成及胃酸和胃蛋白酶的减少均能增加胃癌发生的危险性。二则由于为了维持胃黏膜的完整性,胃黏膜细胞代偿性的增殖加快,而在细胞增殖过程中可能出现不正常的增加,有可能与胃癌的发生有关。另外胃癌中AI的降低可能与早期胃癌中,多种原因使野生型p53基因转变为突变型,而后者有明显的抑制凋亡作用有关。

另外,P53与bcl-2在细胞凋亡中的作用已被证实,NO促进细胞凋亡可能是通过促使p53聚集,下调bcl-2,使bax过度表达从而激活caspases蛋白和使DNA裂解[6]。但是NO促进HP引起细胞凋亡的通路还未明了。胃癌的发生是多阶段,多基因调控的进展过程,本实验仅是初步工作,具体机制还有待于进一步研究。

[1]张而立,李松,陈畅,等.一氧化氮与细胞凋亡关系的研究进展[J].中国生化药物杂志,2007,28(6):427～429.

[2]辛敏,罗伟生.幽门螺杆菌与一氧化氮关系研究进展[J].广东医学,2006,27(3):432～434.

[3]晏楠,吕农华,陈江.幽门螺杆菌感染与细胞凋亡及一氧化氮[J].世界华人消化杂志,2000,8(S):93.

[4]李子俊,陈颜芳,林秋雄,等.一氧化氮在幽门螺杆菌相关性胃病中的可能作用[J].现代消化介入治疗,2000,5(2):35～37.

[5]尹春华,张万岱,曾锦章,等.幽门螺杆菌感染者血清一氧化氮水平及胃粘膜细胞凋亡的变化[J].中国中西医结合脾胃杂志,2000,8(4):219～220.

[6]Borutaite V,Morkuniene R,Brown GC.Nit ric oxide donors,nit rosot hils,and mitochondrial respiration inhibitors inducecaspase activation by different mechanisms[J].Febs Lett,2000,467(2～3):155～159.