养心颗粒含药血清对豚鼠心室肌细胞外向延迟整流K电流的影响

张春芳，客蕊，孟涛，汪洋，周亚滨

(黑龙江中医药大学附属第一医院急诊科，哈尔滨 150040)

养心颗粒由《证治准绳》养心汤化裁而来，具有益气养心安神的作用。临床研究表明［1-4］，其不仅可降低心律失常的发生率，同时还可减少抗心律失常药物的用量。动物实验发现［5-8］，养心颗粒可改善家兔心肌组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATP ase活性，通过阻断心肌细胞Na+通道，抑制Na+离子过度内流，促进K+外流，使冠心病快速型心律失常出现时间延迟、持续时间缩短。但其对心脏钾通道的影响尚未见报道。本实验采用全细胞膜片钳技术观察养心颗粒含药血清对心肌细胞动作电位(AP)及外向延迟整流K电流(Ik)的影响，探讨其抗心律失常的相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雌性豚鼠40只，体质量250～350 g，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号码为:SCXK-［吉］2003-t001。

1.2 药物和试剂 养心颗粒:黄芪、茯神、半夏、当归等十三味中药，由黑龙江中医药大学制剂室制备成颗粒粉末，每克粉末含生药量为6.2g。

HEPES、EGTA、Na2-ATP、小牛血清蛋白(BSA)、胶原酶Ⅱ等购自Sigma公司，台氏液及细胞贮存液(KB)液试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 CEZ-2400型膜片钳放大器;Olympus倒置显微镜;ModelJD200-3精密电子天平;Narishige微电极拉制仪;Sakupa恒温磁力搅拌器;Narishige三维操纵器;Narishige恒流泵;1200 series Interface数-模转换器(美国);Langendorff灌流装置。

1.4 溶液 分离心肌细胞和记录动作电位所需溶液含 Ca2+台式液:(mmol/ml):NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2-2H2O 1.8，MgCl2-6H2O 0.5，NaH2PO4-2H2O 0.25，HEPES 5。用 NaOH 调PH值至7.4。无 Ca2+台式液去掉上述台式液配方中的Ca2+成分即可，其余成分均相同;KB液(mmol/ml):KOH 70，L-谷氨酸 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2-6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，用 KOH 调 pH值至 7.4;灌流液(mmol/L):NaCl 143，KCl 5.4，MgCl20.5，CaCl21.8，NaH2PO40.25，HEPES 5，Glucose 10，用1 mol/L NaOH将pH调至7.4;电极内液(mmol/L):KCl 140，MgCl22，EGTA 2，CaCl21.8，HEPES 5，Na2-ATP 10，用1 mol/L KOH 将pH 调至7.2。实验在室温在22～24℃进行。记录钾通道Ik所需溶液:细胞外液(mmol/L):NaCl 140，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1，CaCl2·2H2O 2.0，Glucose 10，TTX 0.03，HEPES 10，用 NaOH 调pH直至7.2～7.4(室温29℃)。其中 TTX阻断钠通道，Cd2+阻断钙通道。电极液(mmol/L):potassi-um aspartate 80，KCl 42，KH2PO410，Mg2+-ATP 10，phosphocreatin 3，K+-EGTA 5，K+-HEPES 5，用 KOH调 pH 直至7.2 ～7.4(室温29℃)。

1.5 方法

1.5.1 养心颗粒含药血清制备 养心颗粒各组豚鼠每100克体质量灌2 ml药液(7.54 g/kg)，每日给药2次，早晚各1次，空白组给予等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃，连续给药1周，于末次给药后1 h心脏取血，于4℃静置2 h后，低温离心机离心，3500 r/min，离心15 min，将分离的血清同组混合，经56℃恒温灭活30 min处理后，在超净台上用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，－20℃保存备用。

1.5.2 实验分组［9-10］40只豚鼠随机分为4组，空白对照组10只，给予普通细胞外液灌流;2%养心颗粒血清组10只，于普通细胞外液加入养心颗粒血清至其浓度达2%;4%养心颗粒血清组10只，于普通细胞外液加入养心颗粒血清至其浓度达4%;8%组养心颗粒血清组10只，于普通细胞外液加入养心颗粒血清至其浓度达8%。

1.5.3 心室肌细胞的分离［11］豚鼠经戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后给予气管插管，开胸做冠状动脉插管，然后取心脏并固定于langendorff灌流架上，从主动脉逆向灌流含Ca2+台式液2 min后，无Ca2+台式液灌流5 min，最后用胶原酶 (15 mg/100 ml)的无Ca2+台式液灌流10 min，从房室沟处剪下左心室放入细胞贮存液中，振荡10 min(37℃)，吹打成单个心室肌细胞，置于KB液中，4℃冰箱中保存。灌流过程中持续通O2，灌流液温度控制在37℃，灌流速度8 ml/min(室温21℃)。

1.5.4 全细胞记录单个心室肌细胞AP和外向延迟整流钾离子流 选择边缘清楚、横纹清晰的中等大小的心室肌细胞。微电极充灌电极液后，电阻为1～3 MΩ。将已加正压的微电极缓缓插入浴液，直至接触心肌细胞表面，持续负压吸引。当电极尖端与细胞膜表面形成1～5GΩ封接电阻时，用力吸破电极尖端上的膜片，形成全细胞记录。应用电流钳方法，给予时程10 ms、1次/S、幅度为1～2 nA的电流脉冲，引导出豚鼠心室肌细胞的动作电位，并输入计算机分析动作电位的幅度(APA)、静息电位(RP)、Vmax、动作电位复极 50%、90% 时程(APD50、APD90)各项指标。稳定3 min后，分别以普通细胞外液或含2%、4%、8%养心颗粒血清的细胞外液灌流，10 min后再次观察。在全细胞电压钳状态下用钾离子通道外液灌流10 min，稳定10 min后，以递增方式以含养心颗粒血清2%、4%、8%的细胞外液灌流，每一细胞灌流2～3个浓度，再以正常电极外液冲洗10 min，记录不同阶跃电压水平(从－50 mV到+50 mV，每次阶跃命令为+10 mV，时程为400 ms)时的IK电流。为消除细胞间误差，电流大小以电流密度(pA/pF)来表示。

1.5.5 数据的采集及分析 通过膜片钳放大器记录最大峰值的钾电流，放大、滤波后数字信号，由Pclamp 6.03软件控制，其数字化频率为10 kHz，低通滤波器滤波频率为3 kHz。

1.6 统计学处理 采用SPSS14.0软件，所有实验数据用表示，多组间比较用F检验，多组间两两比较用q检验。

2 结果

2.1 试药血清对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响

在分离的单个豚鼠心室肌细胞上，应用全细胞电流钳的方式，引导出单个心室肌细胞的动作电位，测量动作电位的 Vmax、RP、APA、APD50和 APD90的参数。实验中观察了2%、4%、8%的养心颗粒含药血清对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响，见表1。

2.2 试药血清对豚鼠心室肌细胞Ik的作用 在电压钳模式下记录电流，为避免Ik出现随时间而衰减的现象，所有记录均在10 min内完成。将保持电位控制在－50 mV，检测电位从 －50 mV到+50 mV，阶跃命令为+10 mV，时程为400 ms。空白组Ik在－30 mV时被激活，最大外向峰值电流成分在+50 mV，其峰值电流为［(16.11 ±1.67)pA/pF，n=10］，电流对TEA敏感 (5μΜ)，电流成分被明显抑制，表明电流成分对为对TEA敏感的钾电流。Ik电流记录稳定后，加入2%、4%和8%养心颗粒含药血清灌流液，约2 min后，其峰值钾电流分别为［(15.78±1.66)、(15.33 ±1.56)、(14.33 ±1.11)pA/pF，n=10］4%、8%含药血清组明显抑制Ik电流，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表1 试药血清对豚鼠心室肌细胞动作点位的作用()

表1 试药血清对豚鼠心室肌细胞动作点位的作用()

注:与空白对照组比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01

组别 鼠数(只) APA(V/mV) Vmax RP(V/mV) APD50(t/ms) APD90(t/ms)±33.16 285.33 ±37.25 2%养心组 10 110.33 ±7.76 29.67 ±2.42 79.67 ±0.82 221.50 ±35.99 293.17 ±41.47 4%养心组 10 106.17 ±8.45 28.83 ±2.64 79.00 ±1.79 267.33 ±39.83a 341.50 ±42.60a 8%养心组 10 108.83 ±9.15 32.00 ±4.52 79.83 ±1.17 286.50 ±42.28b 356.33 ±26.43空白对照组 10 110.33 ±6.77 31.67 ±3.61 79.67 ±1.63 215.00 b

3 讨论

心肌细胞动作电位的产生与心肌膜上的离子通道、离子流有密切关系，是细胞膜上多种离子通道顺序开关综合作用的结果。动作电位在不同的种属之间存在差异，豚鼠的动作电位平台期很长，比较容易研究药物对动作电位时程的作用。适度延长APD对折返性心律失常的发生有抑制作用。但APD延长超过50%，易引起QT间期延长，则可能诱发早后除极及异常的触发活动，是发生多形性室速的基础。当静息电位水平降低，0期去极化速度减慢，可引起传导性下降，产生单向传导阻滞或传导减慢，两者同时出现易致兴奋折返发生，而引起快速性心律失常。因此，心肌传导性降低也是发生心律失常的原因。

本实验结果显示，养心颗粒4%、8%组均能明显延长豚鼠心室肌细胞动作电位时程APD50和APD90，以养心颗粒8%组影响更明显，但也未超过35%，明显低于致心律失常的值，养心颗粒2%组则无明显影响。提示养心颗粒通过延长动作电位时程，使心室肌有效不应期延长，从而抑制折返性心律失常的形成，且可能有一定的浓度关系。养心颗粒各组对静息电位、0期去极化速度无明显影响。提示养心颗粒对心肌传导性无明显影响，不会引起心律失常。本实验过程中也未发现致心律失常豚鼠。

动作电位时程是各种电流变化的综合结果。既然动作电位时程有变化，必然存在离子电流的改变［12］。除了动作电位开始的0相去极化外，复极化(即1，2，3期)均与K+通道有关，Ik在复极2相激活，是平台期的主要外向电流，对平台期的时程起决定性作用;3相复极早期主要由Ik逐渐增强造成，3相复极晚期由Ik和少量Ik1的外向电流共同形成。Ik是调节豚鼠心室肌细胞复极化的主要离子流，对心室肌细胞动作电位2相平台期的终止及3相复极化具有重要意义［13］，它的改变将直接影响心室肌动作电位时程的长短。

本实验结果显示，养心颗粒4%、8%组峰值钾电流分别为 15.33 ±1.56、14.33 ±1.11，表现为电流密度—电压曲线上移，对豚鼠心室肌Ik均有明显的抑制作用，养心颗粒2%组则无明显影响。提示养心颗粒通过抑制延迟整流 K+通道来延长ADP50、ADP90，从而延长有效不应期，发挥其抗心律失常的作用，且可能有一定的浓度依赖性。

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