负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响*

刘志鹏,王宗华,梁光萍,熊晓峰,范亚川,邹利全,王洪斌,陈 陵,李学成△

(1.中国人民解放军第三二四医院消化内科,重庆400020;2.第三军医大学护理学院,重庆400038;3.第三军医大学西南医院烧伤研究所,重庆400038)

端粒酶通过延长染色体末端端粒,维持细胞永生化能力。而人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的限速成分,直接决定了端粒酶活性[1]。目前有关hTERT的调控机制尚未完全明确。有关hTERT表达调控的研究大多为转录水平的调节,未涉及转录后的调节。但是转录水平的调节因子众多,关系复杂,很难通过控制转录水平的调节有效控制hTERT的表达。转录后的调节主要涉及微RNAs(miRNA)。miRNA是最大的一类基因表达转录后调控因子,极微量的miRNA即可对靶蛋白的表达产生有效的调控作用。研究hTERT在转录后水平的调控,对理解肿瘤发生发展机制,以及基于miRNA的肿瘤诊断与治疗具有重要意义[2]。在前期工作中成功包装了负载miR-138的腺病毒[3],在本研究中,进一步研究基于腺病毒载体的miRNA表达调控效果,为基于miRNA的hTERT转录后调控机制的研究,以及基于hTERT调控相关miRNA的肿瘤诊断与治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 标准胎牛血清,高糖DM EM培养液、RPM I 1640培养液以及胰酶消化液(美国 HyClone公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司),焦碳酸二乙酯水(北京天根公司),逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR试剂盒(日本TAKARA公司);MPERTM蛋白提取试剂(美国 Pierce公司);蛋白酶抑制剂(美国Sigma公司);BCA蛋白定量试剂盒(上海申能博彩公司);转化有腺病毒E1区基因的包装细胞 HEK293,本室保存。负载有miR-138表达序列的复制缺陷型腺病毒(Ad-miR138),由本室构建并保存[3];负载有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因 LacZ的复制缺陷型腺病毒,由西南医院心内科唐兵博士惠赠。U6及miR-138特异 RT及 real-time PCR引物(广州锐博公司);hTERT mRNA的real-time PCR引物由上海生工合成纯化,其上游序列 P1:5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′;下游序列 P2:5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′,扩 增片段长度144 bp[4];ABI 7500荧光定量 PCR仪(美国 AB公司)。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒感染BGC-823细胞 负载miR-138的复制缺陷型腺病毒(Ad-miR138)在前期工作中已纯化、浓缩并已测定滴度[3]。将浓缩的腺病毒液取出后,按200∶1的感染复数(MOI)感染BGC-823细胞,继续培养 72 h后,分别检测miR-138、hTERT mRNA以及hTERT蛋白表达水平。以感染负载有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因 LacZ的复制缺陷型腺病毒的BGC-823细胞作为阴性对照,未感染腺病毒的BGC-823细胞作为空白对照。

1.2.2 总RNA抽提 消化细胞后计数,取107个细胞以200 g离心5 min,弃去上清后加 Trizol试剂1 mL,反复吹打。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA,再将总RNA溶于DEPC水中,用紫外分光光度仪测定RNA浓度和纯度。

1.2.3 逆转录反应及实时荧光定量PCR反应(real-time PCR) 以U6管家基因作为内参,校正器参考文献[5]方法,选用未感染病毒的空白对照组BGC-823细胞(ZERO)作为校正器,每个标本设3个复孔。取总RNA 100 ng为模板,按照逆转录试剂盒说明书配20 μ L反应体系,反应条件为42℃15 min,85℃5 s;然后按照real-time PCR试剂盒说明书,取合成的cDNA 4 μ L为模板,配25μ L反应体系,预变性95℃30 s,反应40个循环,条件为 95℃5 s,60℃34 s。采用2-△△Ct法进行结果分析,将不同标本的RQ值(RQ=2-△△Ct)进行比较。△Ct=目的基因Ct值-内参照基因Ct值,△△Ct=待测标本的△Ct-校正器△Ct。

1.2.4 Western Blot实验 消化细胞后计数,取107个细胞以200 g离心5 min,弃去上清后以M-PERTM蛋白提取液处理细胞,收集细胞总蛋白,BCA法定量后经SDS-PAGE,电转膜,免疫抗体反应,最后化学增强发光法(ECL)显带,具体步骤按文献[6]操作,以GAPDH为内参照。

2 结 果

2.1 real-time PCR检测miR-138的表达丰度 熔解曲线显示,U6与miR-138呈单峰,扩增曲线呈S形,表明引物特异性好,real-time PCR结果可靠。

表1 miR-138、hTERT mRNA在各组细胞中的相对表达定量(±s)

表1 miR-138、hTERT mRNA在各组细胞中的相对表达定量(±s)

*:P＜0.05,与Ad-NC组比较。

BGC-823细胞分组miR-138相对表达定量hTERT mRNA相对表达定量ZERO 1.085±0.478 1.02±0.34 Ad-NC 0.928±0.199 1.32±0.67 Ad-miR138 9.152±2.641* 0.91±0.35

图1 Western Blot检测 BGC-823细胞内hTERT蛋白的表达

2.2 real-time PCR检测Ad-miR138感染后BGC-823细胞内miR-138、hTERT mRNA表达丰度的改变 分析结果显示,与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞组(Ad-NC)相比,未感染腺病毒的空白对照组(ZERO)的BGC-823细胞内miR-138的表达差异无统计学意义(P＞0.05);而感染Ad-miR138腺病毒的BGC-823细胞(Ad-miR138)内miR-138的表达丰度则显著增加(P＜0.05)。3组 BGC-823细胞 hTERT mRNA的表达水平各组间差异无统计学意义。见表1。

2.3 Ad-miR138感染BGC-823细胞后hTERT蛋白表达的变化 结果显示,BGC-823细胞感染负载miR-138的腺病毒AdmiR138后,hTERT蛋白的表达下调,见图1。

3 讨 论

hTERT仅在肿瘤组织及极少部分正常组织中表达,而绝大多数正常组织中无表达[7]。以hTERT为靶标的抗肿瘤治疗研究是当前的一个重要策略[8]。本文前期工作发现,将hTERT全长cDNA导入树突状细胞(dendritic cells,DC),在体外[9]及裸鼠体内[10]均可有效激发针对端粒酶的特异细胞毒性T淋巴细胞反应,对多种端粒酶阳性的肿瘤细胞具有明显的杀伤效果;进一步研究发现,将hTERT全长cDNA转染至端粒酶阴性的骨肉瘤细胞系U-2 OS后,其增殖能力及侵袭能力增强,提示hTERT不仅参与肿瘤的发生,而且还参与肿瘤的转移过程[11]。因此在转录后水平抑制hT ERT蛋白表达的相关miRNA可作为潜在的肿瘤治疗靶位。目前已发现miR-138可在转录后水平抑制hTERT表达。因此,通过上调miR-138表达丰度而抑制hTERT蛋白表达水平,有可能抑制肿瘤细胞端粒酶活性,进而抑制肿瘤增生与转移。人类基因组中至少存在数千条miRNA,是最大的一类转录后调控因子[12]。由于miRNA对包括肿瘤相关蛋白在内的多种蛋白起着关键的调节作用,其表达谱的改变,在多种肿瘤的发生发展过程中有重要作用,有可能作为肿瘤早期诊断的治疗靶标[13-15]。目前存在3种方式对miRNA进行安全而高效的调控。(1)人工合pre-miRNA的短核苷酸片段,采用转染试剂将片段转入细胞,在细胞内Dicer酶作用下,形成成熟的miRNA片段而发挥功能。优点是简单易行,效果确实,但不足之处是一次转入短核苷酸片段后,不能持续高水平表达目的miRNA。并且由于要用到转染试剂,无法在体内进行。(2)将pre-miRNA片段克隆至质粒表达系统,再转染质粒至细胞。这一方法优点是细胞内可持续较高水平表达目的miRNA,但还是只适合用于体外。(3)采用病毒载体方法,如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等。本文在研究中采用腺病毒载体系统。腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类基因的表达,在大多哺乳动物细胞和组织中均可表达重组基因,并且腺病毒具有嗜上皮细胞性,而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的,非常适于靶向肿瘤的基因治疗载体[16]。另外,腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚,在人群中早已流行。人感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状,且腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,不会干扰其他的宿主基因。作者在前期研究中成功包装负载miR-138前体(pre-miR-138)cDNA的腺病毒表达载体[3]。在本研究中进一步发现,利用腺病毒载体技术可有效上调肿瘤细胞内miRNA的表达丰度,进而有效抑制靶基因的表达。这一发现为基于hTERT调控相关miR-138的肿瘤免疫基因治疗奠定了基础。需进一步深入研究的问题是,上调肿瘤组织内hTERT调控相关miR-138表达丰度后,虽然可以抑制hTERT蛋白的表达,但由于miRNA对靶基因是微调作用,无法完全封闭hTERT表达,那么未被抑制的hTERT活性在多大程度与范围内是否可以继续维持肿瘤细胞的生长与增殖,采用腺病毒负载的hT ERT调控相关miR-138是否能有效抑制hTERT阳性的肿瘤细胞增殖与转移,这些问题有待进一步探讨。

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