银杏叶提取物对大鼠重症急性胰腺炎肾损伤的保护作用及机制研究

何 彩,王 煊,邓明明,周正端,刘 宏,屈小平

(泸州医学院附属医院消化内科,四川泸州646000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是临床常见的危重症之一,随着生活水平的提高和饮食结构的改变,其发病率有所上升,死亡率居高不下。SAP并发肾脏损伤是SAP死亡率高的重要因素之一。目前有关炎症介质在SAP发病机制中的作用逐渐受到关注,但SAP肾损伤与炎症介质之间的关系尚未明了,因此本研究拟通过观察Toll样受体4/核因子κ B(toll-like receptor 4/nuclear factor kappa B,TLR4/NF-κ B)炎症信号转导通路和肾脏功能及组织形态学变化,探讨银杏叶提取物对大鼠SAP肾损伤的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雌性Sprague-Dewley(SD)大鼠90只,体质量200～240 g(购自泸州医学院动物科);银杏叶提取物(购自黑龙江省珍宝岛制药有限公司);牛磺胆酸钠(购自Sigma公司);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-1,IL-6)的ELISA试剂盒(均购自博士德公司);兔抗大鼠T LR4多克隆抗体(购自博澳森公司);小鼠抗大鼠NF-κ B多克隆抗体(购自Santa Cruz公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和模型的复制 雌性SD大鼠90只,体质量200～240 g,随机分为假手术组(N组),重症急性胰腺炎模型组(P组),银杏叶提取物治疗组(S组),每组 30只。P组和 S组采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射方法复制大鼠重症急性胰腺炎模型,N组开腹后翻动肠壁即关腹。术后禁食,清醒后自由进水。S组大鼠在术后10 min给予银杏叶提取物(6.25 mg/kg)尾静脉注射;P组大鼠采用同样方法给予等量的生理盐水。于12、24、48 h时间点每组分别处死10只,光镜下P组和S组各时间点均选择6只造模成功的大鼠进入检测,以光镜下胰腺组织坏死、出血为造模成功。

1.2.2 肾脏组织形态学观察和病理学评分 常规HE染色并观察,以改良的 Rabb等[1]和 Solez等[2]法,对肾脏损伤进行评分。

1.2.3 尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(crea,Cr)的测定 用全自动生化分析仪检测。

1.2.4 TNF-α和IL-6的测定 大鼠血清 TNF-α和 IL-6的测定均使用ELISA法,按试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 肾脏组织中的TLR4和NF-κ B的表达 均采用肾脏石蜡组织块行免疫组织化学法(SABC法)测定。1.3 统计学处理 各组数据均以±s表示,结果用SPSS 16.0统计软件分析。多样本均数比较采用方差分析,检验水准α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肾脏组织形态学观察和病理学评分 常规HE染色光镜下N组各时间点大鼠肾脏组织未见异常。随时间延长,P组肾小球淤血,肾小管上皮细胞肿胀,间质水肿及炎细胞浸润逐渐加重。S组和P组相比,12 h时间点大鼠肾脏组织改变无明显差异;24 h和48 h时间点有所减轻。肾脏组织病理学评分示:各时间点P组较N组明显增高(P＜0.05),S组与P组比较,评分降低,但12 h时间点差异不具有统计学意义(P＞0.05),24 h和48 h时间点比较差异具有统计学意义(P＜0.05),见表 1。

2.2 血清BUN和Cr的变化 BUN和Cr在P组和S组大鼠血中的浓度呈逐渐增高趋势。其中12 h时间点比较,P组高于N组(P＜0.05),S组与P组无明显差异(P＞0.05);24 h和48 h时间点比较,P组均高于N组(P＜0.05),S组均低于P组(P＜0.05),见表2。

2.3 血清 TNF-α和 IL-6的变化 造模后大鼠血清TNF-α和IL-6随着时间的延长而逐渐升高。P组各时间点TNF-α和IL-6的浓度较N组均明显增高(P＜0.05),S组的浓度较P组均明显降低(P＜0.05),见表 3。

表1 各组大鼠肾脏组织病理学评分的变化(±s,n=6)

表1 各组大鼠肾脏组织病理学评分的变化(±s,n=6)

*:P＜0.05,与N组比较;▲:P＜0.05,●:P＞0.05,与P组比较。

组别 12 h 24 h 48 h N 组 0.67±0.52 0.83±0.41 1.00±0.63 P组 5.17±0.75* 9.50±1.05* 12.00±0.89*S组 4.67±0.82● 7.83±0.75▲ 9.33±0.82▲

2.4 肾脏组织中TLR4和NF-κ B的蛋白表达变化 免疫组织化学实验结果显示肾脏组织中T LR4和NF-κ B蛋白阳性表达呈棕黄色,主要定位于肾小管上皮细胞胞浆内,N组几乎无表达,在P组和S组随时间延长阳性产物的密度和染色深度增强。其中各时间点P组T LR4和NF-κ B蛋白阳性表达高于N组(P＜0.05),S组的表达有所降低,低于P组(P＜0.05),见封 3图 1、2,封 4图 3～ 6,表 4。

表2 各组大鼠血清BUN和Cr的变化(±s,n=6)

表2 各组大鼠血清BUN和Cr的变化(±s,n=6)

*:P＜0.05,与N 组比较;▲:P＜0.05,●:P＞0.05,与P组比较。

组别BUN(mmol/L)12 h 24 h 48 h Cr(μ mol/L)12 h 24 h 48 h N 组 6.54±0.71 6.58±0.48 6.95±0.89 35.30±4.77 36.72±6.55 37.32±6.17 P组 8.76±0.77* 15.05±2.07* 23.04±6.30* 69.27±5.29* 103.60±11.22* 182.08±24.35*S组 8.32±0.64● 11.04±1.57▲ 16.15±1.41▲ 64.67±3.46● 77.12±9.57▲ 136.12±11.82▲

表3 各组大鼠血清TNF-α和IL-6的变化(±s,n=6)

表3 各组大鼠血清TNF-α和IL-6的变化(±s,n=6)

*:P＜0.05,与N组比较;▲:P＜0.05,与P组比较。

组别T NF-α(pg/mL)12 h 24 h 48 h IL-6(pg/mL)12 h 24 h 48 h N 组 21.25±2.75 22.30±4.00 24.22±3.80 44.91±4.14 46.49±5.17 47.90±5.34 P组 52.91±6.55* 82.63±6.15* 103.65±9.96* 103.76±10.25* 140.39±11.28* 164.24±10.88*S组 40.50±6.61▲ 66.70±4.69▲ 89.46±6.20▲ 77.31±8.69▲ 119.49±9.66▲ 138.26±12.51▲

表4 各组大鼠肾脏组织 TLR4和 NF-κ B的积光分密度(IOD)平均值的变化(±s,n=6)

表4 各组大鼠肾脏组织 TLR4和 NF-κ B的积光分密度(IOD)平均值的变化(±s,n=6)

*:P＜0.05,与N组比较;▲:P＜0.05,与P组比较。

组别T LR4 12 h 24 h 48 h NF-κ B 12 h 24 h 48 h N 组 7.21±0.92 7.44±0.69 7.59±1.08 7.65±0.89 7.76±0.65 7.91±0.87 P组 24.56±3.68* 38.84±4.10* 54.35±5.34* 28.76±5.15* 42.71±5.35* 53.05±5.07*S组 18.42±3.25▲ 29.20±4.76▲ 40.50±5.41▲ 22.51±3.35▲ 34.20±5.39▲ 43.79±4.74▲

3 讨 论

TLR4是T LRs家族中介导内毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)应答的最重要受体,作为机体炎性反应链的启动蛋白,它通过对病原相关分子模式中的特有抗原成分进行信号识别、转导,而 LPS作为 TLR4最重要的配体,与 TLR4/NF-κ B信号转导通路关系密不可分。其信号转导通路主要包括髓样分化因子88(myeloid differentiation factor,MyD88)依赖和MyD88非依赖通路,NF-κ B是通路中的一个至关重要的点。其中最重要的MyD88依赖的信号转导通路主要介导NF-κ B的活化和炎症细胞因子 TNF-α和 IL-6等的产生[3-8]。正常情况下,TLR4在肾脏组织的表达很弱,病理状态下,表达增强[9-10]。在本实验中,P组大鼠肾脏组织的T LR4、NF-κ B蛋白表达都较N组明显上调,P组大鼠血清 BUN、Cr、TNF-α、IL-6较N组增高,肾脏组织病理学评分也高于N组,表明SAP肾损伤与TLR4、NF-κ B的异常表达相关。其机制可能是由于SAP早期的肠源性细菌移位,肠道感染中的细菌多以革兰阴性菌为主,其细胞壁中的 LPS与肾脏组织中的TLR4结合,TLR4表达增强,引发一系列的胞内信号转导,使得 TLR4/NF-κ B信号转导通路被激活,其下游炎症介质 TNF-α、IL-6等释放而损伤肾脏组织,致使肾功能受损。实验表明,TLR4可能在SAP肾损伤中起着重要的作用,担当着炎症反应途径的“阀门”。

有学者对大承气汤治疗SAP大鼠的实验研究表明其可能通过减少致炎因子或增加抑炎因子来影响SAP的炎性反应[11]。目前对药用植物银杏之银杏叶提取物用于治疗SAP研究较少,银杏叶提取物在我国取材方便,应用广泛,不良反应少。银杏叶提取物的主要成分包括银杏叶黄酮苷、银杏叶内酯和银杏新内酯等。现代药理研究表明:银杏叶提取物具有抗氧化、清除自由基、改善微循环、提高神经可塑性等作用[12-13]。银杏叶提取物中含有的银杏内酯被认为是PAF受体的特异性拮抗剂,可降低血液黏滞度,抑制血小板功能,改善微循环[14]。有学者研究银杏叶提取物对早期糖尿病患者氧化应激的影响,发现经银杏叶提取物治疗后的糖尿病患者血清丙二醛下降,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶升高,提示银杏叶提取物可能通过抑制氧化应激反应,对早期糖尿病肾病患者起到肾脏保护作用[15]。杨珍[16]通过对生长抑素联合银杏叶提取物注射液治疗急性胰腺炎的临床研究提示:舒血宁可改善胰腺血液循环,增加器官血液灌流,改善缺血,预防血栓形成,防治胰腺缺血、坏死,减少胰源性物质损伤肾脏。本实验显示,与P组大鼠比较,经银杏叶提取物治疗的S组大鼠其肾损伤无论在大体形态上,还是肾组织病理评分方面,程度都明显减轻,血清中BUN和Cr浓度也低于P组,表明银杏叶提取物对大鼠SAP肾损伤具有保护作用。而银杏叶提取物是否能抑制 TLR4/NF-κ B信号转导通路,减少炎症介质的产生是实验研究的重点之一。

实验中银杏叶提取物治疗后的S组与P组相比,大鼠肾脏组织的T LR4、NF-κ B蛋白表达降低,血清中 TNF-α、IL-6不同程度的降低,说明银杏叶提取物能调节机体的免疫应答,达到保护机体的作用。推测其机制:银杏叶提取物可能减少了LPS与脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)及CD14形成复合物,复合物与T LR4的结合减少,从源头抑制了 T LR4/NF-κ B信号转导通路中 T LR4的活化,也可能抑制T LR4/NF-κ B信号转导通路中的 TLR4和NF-κ B两个关键因子的活化,阻断了TLR4/NF-κ B信号转导通路中下游炎症介质释放,从而减轻了炎症介质对组织的损伤,最终发挥对SAP肾损伤的保护作用[17-19]。

目前国内外报道银杏叶提取物用于治疗SAP肾损伤的研究很少,对银杏叶提取物是否可抑制 TLR4/NF-κ B信号转导通路的研究未见相关报道。本实验中,大鼠SAP肾损伤时,应用银杏叶提取物治疗后,肾脏组织中的 TLR4和 NF-κ B蛋白表达减弱,从而减少了炎症介质 TNF-α、IL-6等的释放,TNF-α和IL-6释放减少,也可能反向减低了 NF-κ B的活化[20],并且随着炎症介质的减少和微循环的改善,肠源性细菌移位和内毒素血症得到缓解,LPS与TLR4的结合受到抑制,“环式”炎症网络得到有效控制,达到治疗SAP肾损伤的作用[21]。说明银杏叶提取物有较好的临床应用前景,可能为临床急性胰腺炎肾损伤的治疗提供新的途径。

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