贵州省新发现HIV-1毒株亚型特征研究*

孙显光,何 翔,李志坚,张信辉,申莉梅

(1.贵州省CDC艾滋病性病皮肤病防治研究所艾滋病二科,贵阳550002;2.中国CDC艾滋病艾滋病预防控制中心病毒免疫室,北京100050)

艾滋病病毒为了适应新的环境,必然通过变异或重组方式改变其属性来求得生存[1-2]。艾滋病病毒亦称人类免疫缺陷病毒,简称HIV,属RNA逆转录酶病毒,具有高度的遗传变异性,容易通过基因重组方式产生新的毒株或亚型。HIV分HIV-1、HIV-2两个型别,我国以 HIV-1流行为主。目前全球HIV-1共发现14种亚型,我国31个省发现9种亚型[3],其中本省发现7种。随着HIV-1在本省流行时间的延长,其亚型内的变异也会越来越大。研究HIV毒株的基因亚型特征,具有重要的现场实用性,有助于从分子流行病学角度掌控HIV的流行状况、制定预防干预措施以及疫苗的研制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 安顺地区采样41份,全为吸毒传播样本;贵阳、黔东南两地区采样19份,全为性传播样本;铜仁、六盘水、黔南3个地区采样68份,包括血液传播样本29份、吸毒传播样本26份、性传播样本13份。病例对象全部为2007年新发现的HIV感染者并签订知情同意书。对照病毒株采用国际标准亚型参考株。

1.2 核酸提取 采用 Qiangen公司的 QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒,按说明书操作。

1.3 基因扩增与测序分析

1.3.1 引物 用中国疾病预防控制中心合成的NP21和NP22引物对为外侧引物(ACA GTR CAR TGY ACA CAT GG,CAC TTC TCC AAT TGT CCI TCA);Env-C和Env-D3引物对为内侧引物(CTG TTI AAT GGC AGI CTA GC,RAT GGG AGG RGY ATA CAT)。

1.3.2 方法 按Nested基因扩增方法(PCR)进行。即:用5μL核酸样品与 NP21/NP22初次扩增,95℃1 min;94℃30 s,56℃1 min,72℃2 min,30个循环;72℃10 min。取1/10的反应产物再与Env-C、Env-G做第2次扩增,95℃1 min;94℃20 s,54℃1 min,72℃1.5 min,30个循环;72℃10 min。

1.3.3 PCR产物纯化 采用Qiangen公司的Qiaex试剂盒,按说明书提纯 HIV基因片断,回收 DNA溶于 10 mmol/L Tris-HCl,pH8.7,经琼脂糖凝胶电泳后与标准品对照计算核酸浓度。

1.3.4 核酸序列测定 1 μ g样品与6 pmol/L引物经测序反应提纯后,在 ABI公司3100A型DNA测序仪上进行序列测定。

1.3.5 序列分析 采用目前国际通用的基因序列分析方法。即:所测序列经DNA软件编辑后用GCG软件包进行分析。以Pileup程序进行排序并与国际标准序列进行比较,以Pretly程序计算共享序列,用Distance程序测定毒株间序列离散率,用Growtree程序做系统树状分析。

1.3.6 HIV-1毒株亚型的判定 利用计算机软件模型将样本基因序列与国际标准参考株基因序列进行比对、构建系统进化树、确定HIV毒株亚型是目前国际公认的基因序列分析方法。用此法分析获得gag和env基因区序列,分别确定不同基因的亚型;对于新发现的重组模式的序列进行重组断点分析,结合2个基因片段的结果最终确定样本亚型[4-5]。

3.7 统计学处理 采用SPSS 17进行统计分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1贵州省HIV-1毒株亚型分布结果 此次研究共发现4种HIV-1亚型毒株,其中CRF01-AE为贵州省首次发现,且占检出毒株的52.1%(62/119),是本次研究发现的优势流行毒株,见表1。

表1 119例HIV-1样本亚型分布

2.2 贵州省HIV-1亚型毒株系统进化树分析结果 119例HIV-1亚型毒株经gag基因和env基因系统进化树分析,结果CRF01-AE的gag基因与国际标准株相近度达100%,其env基因与国际标准株相近度达96%,CRF07-BC的gag基因与国际标准株相近度达100%,其env基因与国际标准株相近度达98%,见图 1、2。

2.3 贵州省HIV-1流行毒株组内基因距离分布情况 此次研究结果01-AE基因离散率远比07-BC基因离散率小,表明01-AE亚型毒株在贵州的流行时间较短,见表2。

表2 119例HIV-1流行毒株组内基因距离分布

2.4 贵州省HIV-1各亚型毒株在不同人群中的分布 用不同地区测序成功病例数与各亚型所占比例数进行统计分析,发现它们之间差异有统计学意义(P＜0.05),见表3。

表3 119例HIV-1亚型毒株在不同地区及传播人群中的分布

图1 贵州省HIV-1毒株env基因系统进化树分析

图2 贵州省HIV-1毒株gag基因系统进化树分析

3 讨 论

3.1 亚型毒株分布特征 本次研究通过HIV-1毒株外膜蛋白扩增和基因序列测定分析,贵州省119份样本有CRF01-AE、CRF07-BC、B、CRF08-BC 4种亚型,以CRF01-AE 重组亚型为主要流行株,CRF07-BC次之。其中,CRF01-AE亚型毒株主要从铜仁、安顺地区的样本中检出,CRF07-BC亚型毒株主要从安顺和贵阳地区的样本中检出,而为数较少的B亚型和CRF08-BC亚型毒株则主要从黔东南和贵阳地区的样本中检出。CRF01-AE和CRF07-BC亚型为主要流行毒株,CRF01-AE亚型毒株62例占总样本数的52.1%,CRF07-BC亚型毒株49例占总样本数的41.2%,且均为基因重组亚型。值得注意的是,在贵州省以往的研究中只检出 B、B′、E、CRF07-BC、CRF08-BC亚型[6-7],CRF01-AE亚型毒株为此次研究发现。目前为止,贵州省 HIV-1毒株已检出 B、B′、C、E、CRF07-BC、CRF08-BC、CRF01-AE 7种亚型。由此可见贵州省HIV-1毒株亚型种类繁多、分布广泛而复杂。这必将给今后的防治工作带来较大的难度。

3.2 亚型毒株的流行链 根据树状图和表1分析,此次研究发现的CRF01-AE占较大比例,且在贵州首次发现,是贵州省HIV-1亚型毒株流行特点的重大变化。据报道,此毒株源于泰国性服务人群,经我国东南沿海多次传入我国,主要在性传播人群引发流行[8-9]。结合流行病学资料推测,贵州省 HIV-1 CRF01-AE亚型毒株,首先经劳务输出的沿海各省打工人群带入本省,先在性服务人群中流行,然后再传给吸毒人群。显示贵州省HIV流行,以吸毒为主的传播方式已逐步向性传播方式扩散,应该引起高度重视。

CRF07-BC亚型毒株是本次研究发现的第二优势亚型毒株。据文献报道,该毒株由20世纪90年代中期从印度传入缅甸,再传入我国云南瑞丽的C亚型病毒与早先从缅甸传入我国云南瑞丽的B′亚型病毒重组而成(CRF07-BC、CRF08-BC),此亚型毒株主要在吸毒人群中蔓延传播[10-12]。鉴于贵州省早期研究中就已发现C、B′两种亚型毒株[6],推断贵州省CRF07-BC亚型毒株的形成,有可能通过性传播杂交和共用注射器吸毒杂交两种方式形成,主要通过云南、四川、广西传入[13-14]。

本次研究发现B、B′亚型毒株相对较少,不再成为贵州省HIV-1亚型毒株流行的优势毒株。由于B亚型毒株主要由泰国传入云南,再由云南传入河南[15],由到河南卖血人员带入贵州省。表明,通过取缔地下卖血,保障血液安全等措施成效显著,输血传播已经遏制。同时也说明输血传播的感染者相对稳定,向周围人群扩散不如吸毒或性传播方式快,形成二代传播少。

3.3 HIV-1亚型毒株在不同地区传播人群中的分布 此次研究结果经统计分析发现,各亚型毒株在不同地区传播人群中的分布,存在显著差异。尤其值得高度重视的是铜仁等地区的亚型毒株分布与以前的研究结果大相径庭,以前的结果为B、CRF07-BC亚型毒株流行为主,而此次则以CRF01-AE流行为主,CRF01-AE所占比例为82.54%。由此表明:在一定区域内,新的HIV亚型毒株一旦形成,即可很快成为这一区域的优势毒株。

3.4 防治对策 通过本次研究结果分析发现,贵州省HIV-1流行优势毒株已不再是以前的B、B′亚型毒株,而是CRF01-AE亚型毒株。因此建议,在HIV防治对策上,亦应对以往所采取的以阻断吸毒人群传播为主的防治措施调整为以阻断性服务人群、社会流动人群、吸毒人群经性传播为主的综合防治措施上来。防治重心、经费投向、政策导向均应作相应的调整。只有这样,进行全方位的HIV综合防治,才能有效地阻止HIV病毒的传播和蔓延,达到控制艾滋病流行的目的。

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