GSTθ转染对宫颈癌HeLa细胞侵袭性的影响

乔惠萍 李启民 陈鹏

(包头医学院第一附属医院放疗科 内蒙古包头 014010)

谷胱甘肽S-转移酶是超基因家族酶,为细胞解毒系统的重要成分,可能保护细胞免受活性氧代谢产物损伤的物质[1～3]。人类GSTθ存在着基因的多态性,如20%的高加索人和80%的亚洲人缺少这种酶。正因为GSTθ的多态性,有可能影响到人类发生暴露相关肿瘤的危险性。GSTθ空白基因型在宫颈癌病人非常常见,在年轻宫颈癌病人的发生较60岁以上病人中更常见。而且,GSTθ空白基因型与低分化肿瘤的相关性更强,这表明携带这种基因的个体对宫颈癌有较高的遗传易感性[5]。

在本研究中通过将GSTθ基因,稳定地转染到了人类宫颈癌HeLa细胞,并观察了转染后GSTθ高水平表达对细胞生长及细胞侵袭能力的影响,以了解GSTθ基因改变可能对肿瘤细胞的生物学作用,从而为GSTθ基因作为肿瘤抑制基因为肿瘤基因治疗提供实验基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人类宫颈癌HeLa细胞株购自美国ATCC菌种保藏中心,新生小牛血清(美国Gibco),DMEM冻干粉(美国Gibco),MTT(普飞生物科技公司),DMSO(国药集团),酶标仪(Bio-TEK公司),CKX41倒置显微镜、C-7070数码相机(OLYMPUS),pcDNA3(美国Invitrogen公司),Lipofectamine(美国Invitrogen公司),Trizol(加拿大Bio Basic公司),逆转录试剂盒(加拿大Bio Basic公司),PCR扩增试剂剂盒(上海生工)。

图1 HeLa细胞在GSTθ表达。收集呈指数生长的细胞并按“材料和方法”中所描述在采用RT-PCR法测定GSTθ mRNA的表达水平。图所示为三次重复实验中一典型的实验结果。图中,M,DNA marker;1和3为未HeLa母细胞;2和4为HeLa-GSTθ细胞。GADPH mRNA同时测定作为样本间的对照。

1.2 方法

1.2.1 GSTθ细胞转染和GSTθ高表达稳定细胞的建立 一全长人类GSTθ cDNA定向地克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,采用脂质体介导转染方法根据其提供的使用说明书将构建好的pcDNA3/GSTθ载体导入HeLa细胞中,并在含有500μg/mL G418的培养液进一步筛选培养。大约2～3周后,可见典型的抗G418的克隆形成。克隆细胞再进一步培养和扩展,最后采用RTPCR检测克隆细胞中GSTθ基因mRNA表达水平。转染了pcDNA3-GSTθ的HeLa细胞则命名为HeLa-GSTθ。

1.2.2 RT-PCR办法 收集取对数生长期的未转染的HeLa母细胞和HeLa-GSTθ细胞,采用Trizol按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA,紫外分光光度计分别测定RNA纯度(A260/A280>1.90)。用DEPC水调整RNA浓度为5μg/μL。各取总RNA1μL,加入1μLOligo(dT),10μLDEPC水,轻混70℃水浴5min,并在冰浴冷却30s。然后在冰上加入4μL5x反应液,1μLRNase抑制剂(20U/μL),2μLdNTP混合液(10mmol/L),在37℃水浴加热5min,加入1μLM-MuLV反转录酶(20μ/μL),在37℃逆转录为1h,最后在70℃灭活逆转录酶10min,置-20oC冰箱保存备用。

图2 GSTθ高水平表达对细胞生长的影响。 采用“材料和方法”中所描述的细胞计数法测定细胞的生长。

图3 划痕实验0hHeLa母细胞图象

图4 划痕实验0hHeLa-GSTθ细胞图象

图5 划痕实验72hHeLa母细胞图象

图6 划痕实验72hHeLa-GSTθ细胞图象

根据Genebank中GSTθ(GSTT1, NP_000844)的基因序列,采用引物设计软件primer premier 5进行引物的设计。引物序列分别为:GSTθ上游引物5’-CCC GGA TCC CGC ATG GGT CTG GAG CTC TAC CTG GAC-3’,下游引物为5’-GGG GAA TTC CCG GAT CAT GGC CAG CAC CCA GGG-3’,扩增产物为723bp。GADPH上游引物为5’-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3’,下游引物为5’-CAA CCT GGT CAG TGT AG-3’,扩增产物为724bp。反应条件为:48℃逆转录45min;94℃灭活及预变性2min;再经58℃45s,72℃45s,反应32个循环,68℃延伸7min。最后,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察并拍照。

1.2.4 细胞记数 采用0.25%胰酶消化收集对数生长期HeLa细胞和HeLa-GSTθ细胞,细胞计数后制成2×104/mL细胞悬液,并接种于六孔培养板。细胞然后连续培养8d,每组设3个复孔,每天进行细胞计数,最终绘制生长曲线。

1.2.5 划痕拍照方法 分别取对数生长期的HeLa母细胞和HeLa-GSTθ细胞,以106/mL的浓度接种于35mm培养皿中,培养至细胞完全饱和。用无菌200μL的枪头在每皿细胞中划出一条等宽直线细痕,制作细胞伤口模型;无菌PBS清洗3次以除去漂浮细胞。此时设为划痕后零时,拍照。继续培养,每隔24h在显微镜下观察划痕宽度,采并用数码相机拍照记录。

2 结果

2.1 GSTθ高表达HeLa稳定转染细胞的建立

如图1所示,HeLa母细胞含有低的GSTθmRNA表达水平, 而转染了pcDNA3-GSTθ载体的HeLa-GSTθ稳定细胞中GSTθ mRNA的表达则明显提高。这一结果表明GSTθ重组质粒的构建是成功,并能成功在HeLa细胞中稳定转录和表达GSTθ基因。

2.2 GSTθ高表达降低HeLa细胞的生长

我们比较了HeLa母细胞和HeLa-GSTθ细胞的生长。HeLa/GSTθ细胞的生长率明显比HeLa母细胞慢。细胞的倍增时间分别为:HeLa母细胞为18h,而HeLa/GSTθ细胞则为24h。这说明转染了GSTθ可以延迟HeLa细胞的生长。两条细胞生长曲线逐渐分开。

2.3 GSTθ高表达降低HeLa细胞侵袭转移能力

我们应用划痕拍照方法记录了HeLa母细胞和HeLa GSTθ细胞划痕后向空白区域的侵袭生长能力。72h后,HeLa母细胞已经完全将划痕区域长满,而HeLa GSTθ细胞划痕区仍有很大空隙,HeLa GSTθ细胞向其他地方侵袭转移的能力明显比HeLa母细胞低。

3 讨论

在本实验中,我们发现通过GSTθ真核表达质粒pcDNA3-GSTθ稳定转染可以明显地增加宫颈癌HeLa细胞中的GSTθ表达水平,而GSTθ表达水平的增加导致了HeLa细胞的生长率降低,HeLa-GSTθ细胞的倍增时间从18h增加到了24h。这些结果说明GSTθ基因可能是宫颈癌的抑制基因。

肿瘤细胞的生长一般都有向周围组织侵袭的特性,宫颈癌细胞也具有这一特性,临床上常常发现局部晚期的患者,由于肿瘤的侵犯而导致患者失去治疗的机会。在本实验中,我们通过实验证明了转染了GSTθ基因的HeLa-GSTθ细胞侵袭能力明显下降。这一结果说明GSTθ基因有可能降低宫颈癌的恶性程度。

我们所得出的实验,结果尽管机制还不清楚,但这些体外研究为将来GSTθ肿瘤的基因治疗提供了实验基础和依据。关于GSTθ基因通过怎样的渠道影响了细胞增殖周期,其作用的关键点是什么,以及GSTθ基因是怎样影响了宫颈癌HeLa细胞的侵袭能力是我们正在努力工作研究的方向。

[1]Kautenburger T.The gut fermentation product butyrate,a chemopreventive agent,suppresses glutathione S-transferase theta(hGSTT1)and cell growth more in human colon adenoma (LT97)than tumor (HT29)cells[J].Cancer Res Clin Oncol,2005,131(10):692～700.

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