自体DC、CIK回输联合干扰素治疗慢性乙肝的临床观察

康海燕，王建彬*，董江龙，赵子龙，张红霞，王 艳

(1石家庄市第五医院，石家庄050021;2河北医科大学第三附属医院)

目前研究认为，乙肝的主要发病机制与机体感染乙肝病毒(HBV)后产生的免疫反应有关。HBV感染后发生的免疫耐受和慢性乙肝(CHB)与机体抗原提呈细胞［即树突状细胞(DC)］功能缺陷密切相关。DC是迄今体内功能最强大的抗原提呈细胞［1，2］，在免疫应答诱导中有独特的地位，对清除HBV起重要作用。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是新型的免疫活性细胞，具有T细胞的抗肿瘤活性和非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点;CD3+CD56+T细胞是CIK群体中的主要效应细胞。研究表明，将HBsAg致敏的DC、CIK共同培养，可诱导出HBsAg特异性CIK，增强各自的作用。为探讨自体DC、CIK联合干扰素治疗CHB的临床疗效，我们进行了相关临床观察。现报告如下。

1 资料与方法

1．1 临床资料 选择2008年5月～2010年12月在石家庄市第五医院门诊或住院治疗的CHB患者320例，男180例、女140例，年龄18～63(37．8±16．3)岁，病程5～20年;均符合2005年中华医学会肝病学分会、感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准［3］，ALT、AST 均 ＞80 IU/ml，HBV-DNA 定量 ＞1．0 ×106IU/ml，无其他感染及严重并发症。将患者随机分为观察组、对照组各160例，两组临床资料有可比性。

1．2 方法

1．2．1 自体DC、CIK制备 抽取受试者外周静脉血10 ml，肝素抗凝后，用生理盐水与静脉血以1∶1比例稀释后，沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心20 min;取白膜层细胞，用生理盐水洗涤2次，以无血清培养基悬浮细胞终浓度为2×106/ml，置于培养瓶内，37 ℃、5%CO2培养箱孵育3 h，分离黏附细胞及非黏附细胞。黏附细胞用无血清培养基培养，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 kU/L、重组人白介素4(rhIL-4)500 kU/L，在37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天半量换液并添加rhIL-4及rhGM-CSF;第6天加入含前S1的表面抗原20 mg/L、肿瘤坏死因子(TNF)500 μg/L，培养第7天收集活化 DC，对患者行皮下注射。非黏附细胞用无血清培养基悬浮，加入干扰素10 kU/L、IL-2 500 kU/L、CD3单克隆抗体500 μg/L、IL-1 100 kU/L，隔天换液，培养第 7 天加入活化DC，继续培养7 d后收集细胞(即HBsAg特异性CIK)，对患者行静脉回输。

1．2．2 治疗方法 两组均行自体DC、CIK回输治疗，第1天抽血，第7天皮下注射自体DC、第14天静脉回输CIK，并同时行第2次抽血，连续循环三次为一疗程(抽血3次，注射DC 3次，回输CIK 3次)。在此基础上，观察组加用干扰素500万U，隔日1次皮下注射，连续6个月为一疗程。

1．2．3 观察指标 两组治疗前后均检测肝功能(包括 AST、ALT、TBIL)、HBeAg 定量及 HBV-DNA定量。

1．2．4 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件，计量资料用±s表示，组间比较用方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 两组治疗前后肝功能指标变化 见表1。治疗后，对照组 AST、ALT、TBIL 分别降低(32．69 ±5．78)U/L、(30．29 ± 4．58)U/L、(7．41 ± 1．21)μmol/L，观察组分别降低(57．01 ± 8．23)U/L、(42．66 ±6．32)U/L、(9．02 ±0．88)μmol/L;两组比较 P 均 ＜0．05。

表1 两组治疗前后肝功能指标变化(±s)

表1 两组治疗前后肝功能指标变化(±s)

注:与同组治疗前比较，*P＜0．01;与对照组治疗后比较，#P＜0．05

组别 n ALT(U/L) AST(U/L) TBIL(μmol/L)对照组160治疗前 127．37 ±19．69 101．22 ±17．22 28．28 ±4．86治疗后 68．62 ±12．11* 62．02 ±13．25* 22．07 ±4．03*观察组 160治疗前 125．36 ±23．86 112．05 ±19．67 27．53 ±5．09治疗后 57．21 ±11．26*#60．35 ±13．57*#18．37 ±3．94*#

2．2 两组治疗前后HBV-DNA及HBeAg定量变化见表2。

表2 两组治疗前后HBV-DNA及HBeAg定量变化(±s)

表2 两组治疗前后HBV-DNA及HBeAg定量变化(±s)

注:与同组治疗前比较，*P＜0．01;与对照组治疗后比较，#P＜0．05

组别 nHBV-DNA定量(IU/ml)HBeAg定量(S/CO)对照组160治疗前 (5．86 ±0．98)×107 422．86 ±45．23治疗后 (4．65 ±1．23)×105* 260．51 ±35．28*观察组 160治疗前 (7．51 ±2．01)×107 436．27 ±51．23治疗后 (5．67 ±1．51)×104*# 200．17 ±32．11*#

3 讨论

研究表明，CHB的发生、发展与HBV持续感染和机体免疫功能障碍有关［4］。DC是机体中功能最强的抗原提呈细胞，在诱导T细胞抗病毒和抗肿瘤免疫中起核心作用［5］。细胞免疫功能低下、CD4+T细胞功能不足，是导致乙肝慢性化的主要原因。另外，DC也会受到 HBV感染。Beckebaum等［6］研究发现，CHB患者单核细胞来源的DC受到HBV感染后，表现为抗原提呈功能下降，辅助T细胞反应受损。提示HBV感染可抑制DC功能，减弱DC抗原提呈功能及其分泌细胞因子的能力，使HBV感染持续。CHB患者皮下注射自身活化的DC，可明显提高其对机体淋巴细胞的活化能力，诱导针对HBV特异性细胞的免疫反应。

CIK是新型的免疫活性细胞，它是由IFN-γ、IL-2等细胞因子诱导产生的杀伤细胞，具有T细胞的抗瘤活性和MHC限制性杀瘤的优点。将HBsAg致敏的DC与CIK共同培养，可诱导出HBsAg特异性CIK，增强各自的疗效。干扰素是治疗CHB常用的抗病毒药物，主要通过抑制病毒复制实现抗病毒作用;并有广泛的免疫调节特性，包括激活T辅助细胞、抗原提呈细胞等，进而增强宿主对病毒的免疫应答。本研究表明，对CHB患者行CIK自体回输，可有效增强其DC功能，激活细胞免疫，促进病毒清除。两组患者治疗后肝功能、HBV-DNA及HBeAg定量均明显改善，以观察组改善明显。提示利用HBsAg致敏的DC诱导特异性CIK增殖，有望成为临床治疗HBV持续性感染的新途径。

综上所述，DC、CIK回输是治疗CHB的有效疗法，其可有效地改善患者的肝功能，促进肝脏储备能力恢复，清除HBV;DC、CIK联合干扰素治疗CHB疗效更佳。

［1］邢利和，张丽欣，张丽丽．树突状细胞与肝脏疾病的研究进展［J］．中国全科医学，2010，13(32):3701-3703．

［2］Skmd FA，Norio H，Morikazu O．Immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis B virus infection［］．World J Gastronterol，2006，12(18):2876-2883．

［3］中华医学会肝病学分会、感染病学分会．慢性乙型肝炎防治指南［J］．中华肝脏病杂志，2005，13(12):881-891．

［4］李俊卿，周俊英．免疫细胞在慢性乙型肝炎免疫耐受机制中的作用［J］．临床肝胆病杂志，2011，27(4):437-440．

［5］张书广，赵歧刚，李友忠．树突状细胞疫苗的制备及治疗慢性乙型肝炎的疗效观察［J］．山东医药，2005，45(5):7-9．

［6］Beckebaum S，Cicinnati VR，Zhang X，et al．Hepatitis B virus-induced defect of monocyte-derived dendritic cells leads to impaired T helper typeⅠresponse in vitro:mechanisms for viral immune escape［J］．Immunology，2003，109(4):487-495．