连翘三萜类化合物对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制及放疗敏感性的实验研究

王彩莲，殷海涛，刘宝瑞

(1东南大学附属中大医院，南京210009;2南京大学医学院附属鼓楼医院)

前列腺癌(PC)多发生于老年，多数晚期患者对内分泌治疗及放化疗不敏感。三萜类化合物是近年从中药连翘中分离的单体化合物，具有抗肿瘤活性。为探讨连翘三萜类化合物达玛-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇(DM)对人PC-3细胞的增殖抑制及放疗增敏作用，2009～2010年，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 药物、试剂与仪器 人PC-3细胞购自上海细胞生物所，连翘购自南京市同仁药房。二甲基亚砜(DMSO，上海凌峰公司)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，Roche端粒酶检测试剂盒(上海吉泰生物公司)，流式细胞仪(美国)，西门子直线加速器(德国)。

1．2 方法

1．2．1 DM分离 连翘粉碎呈粉末状，8倍量95%乙醇浸泡提取3次，乙醇提取物挥干得浸膏;用水、石油醚、乙酸乙酯分歩萃取法获得连翘乙酸乙酯提取物，干燥后上硅胶柱，经石油醚、乙酸乙酯混合液分次洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪旋干呈粉末状;置真空干燥箱40℃过夜、保存。以50 mmol/L的浓度溶于DMSO液中。

1．2．2 细胞培养 PC-3细胞传代、培养于含15%小牛血清的RPMI-1640培养液中，加入青霉素、链霉素各100 IU/ml，在37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1．2．3 细胞凋亡检测 取 PC-3传代细胞2 ml，以106个/ml密度接种于培养瓶中;细胞贴壁后，将DM液按终浓度 3．13、6．25、12．5、25．0、50．0 μg/ml分为5组，每组2 ml加入培养瓶中，每个浓度培养5瓶。24、48 h后，分别消化、收集经DM作用的细胞，离心、PBS洗涤各2次，4℃乙醇固定过夜。上机测定前离心去乙醇，用PBS洗涤1次;过滤后用PBS液悬浮细胞制成单细胞悬液，加人RNA酶、PI染色液;30 min后按Annexin V-FITC试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测细胞周期，观察细胞凋亡。

1．2．4 端粒酶活性检测 将对数生长期PC-3细胞接种于6孔板中，每组接种9个复孔，每孔接种细胞6×104个。次日分别用含25 μg/ml的DM培养基(DM组)、普通培养基(对照组)替换6孔板的培养液，6、18、48 h后用端粒重复序列扩增法检测PC-3细胞端粒酶活性。

1．2．5 细胞周期相关基因检测 将对数生长期PC-3细胞接种于6孔板中，每组接种3个复孔，每孔接种细胞6×104个。分别用含25 μg/ml的DM培养基(DM组)、普通培养基(对照组)替换6孔板的培养液，18 h后收集细胞，用 Trizol法提取总RNA;用反转录酶AMV反转录mRNA为cDNA，测定cDNA浓度，稀释为25 ng/μl。Real Time PCR循环参数为95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火/延伸30 s，共45个循环。熔融曲线循环参数为95℃ 1 min，从55～95℃逐渐升温，并记录荧光信号。样品均设3个复孔，以提取的总RNA为阴性对照。引物均为跨内含子设计，以免荧光定量PCR过程中可能存在的DNA污染对结果的干扰。PCR序列略。以β-actin作内参，药物作用前细胞RNA作对照，参考文献［1］计算药物作用前后的肿瘤细胞周期相关基因 p21、Cyclin D1、CDC25A、TGF-β、Smad3 mRNA表达。

1．2．6 照射处理及集落形成实验 用6 mV X线对贴壁后的细胞进行照射，分 0、1、2、3、4、6 Gy 6 个剂量，分单纯和联合放疗。联合组在放疗同时按25 μg/ml终浓度加DM液2 ml，接种细胞数较单纯组多，且随照射剂量增加而增多。48 h后用PBS洗涤除去DM液，培养10～14 d后终止培养。弃去培养基，用PBS浸洗2次，纯甲醇固定15 min。弃去固定液，加适量Gimsa应用液染色20 min;然后流水缓慢洗去染色液，空气干燥后在显微镜下计数＞50个细胞数的克隆数，以0 Gy集落形成率作为对照组，计算各剂量组的细胞存活分数;用Sigmaplot统计软件计算细胞存活曲线的D0、N、Dq值。

1．3 统计学方法 采用SPSS11．5统计软件，计量资料用±s表示，组间均数比较用方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同时间、DM浓度诱导PC-3细胞凋亡率比较 见表1。

表1 不同时间、DM浓度诱导PC-3细胞凋亡率比较(%，±s)

表1 不同时间、DM浓度诱导PC-3细胞凋亡率比较(%，±s)

注:与 3．13 μg/ml比较，*P ＜0．05;与 6．25 μg/ml比较，△P ＜0．05

时间DM浓度(μg/ml)3．13 6．25 12．5 25．0 50．0 24 h 8．57 ±0．83 10．05 ±0．42 9．95 ±0．62 10．14 ±0．52 10．27 ±1．33 48 h 14．37 ±2．52 28．07 ±3．06* 45．88 ±4．93＊△ 48．38 ±3．73＊△ 52．34 ±5．50＊△

2．2 DM对PC-3细胞周期的阻滞作用 DM可引起PC-3细胞周期重新分布，增加G1期细胞比例，减少S期细胞比例，且随着作用时间延长和浓度增加，这种趋势更加明显。

2．3 两组不同时间PC-3细胞端粒酶活性比较 见表2。

表2 两组不同时间PC-3细胞端粒酶活性比较(±s)

表2 两组不同时间PC-3细胞端粒酶活性比较(±s)

组别6 h 18 h 48 h对照组1．37 ±0．02 1．42 ±0．05 1．79 ±0．04 DM 组 1．16 ±0．04 1．17 ±0．03 1．83 ±0．03 P ＜0．05 ＜0．05 ＞0．05

2．4 两组细胞周期相关基因mRNA表达比较 见表3。

表3 两组细胞周期相关基因mRNA表达比较(CT，±s)

表3 两组细胞周期相关基因mRNA表达比较(CT，±s)

组别 p21 Cyclin D1 CDC25A TGF-βSmad3对照组 0．38 ±0．09 0．58 ±0．17 0．72 ±0．18 0．43 ±0．12 0．45 ±0．19 DM 组 0．65 ±0．13 0．36 ±0．11 0．47 ±0．22 0．61 ±0．14 0．62 ±0．25 P ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

2．5 两组不同放疗剂量的PC-3细胞存活率比较见表 4。单纯组 D0 值 3．486、N 值 1．523、Dq 值1．466，联合组分别为 2．946、1．318、0．813;两组放射增敏比(单纯组Dq与联合组Dq比)为1．80。

表4 两组不同放疗剂量的PC-3细胞存活率比较(%，±s)

表4 两组不同放疗剂量的PC-3细胞存活率比较(%，±s)

组别0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy 4 Gy 6 Gy单纯组 96．48 ±2．17 87．25 ±3．22 76．84 ±2．26 54．48 ±1．99 41．27 ±2．37 29．34 ±1．65联合组 94．36 ±3．21 79．59 ±2．34 64．65 ±3．07 43．47 ±4．15 31．39 ±2．63 18．87 ±1．70 P ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 讨论

目前，多数对连翘单体化合物功能的研究在其抗炎、抗病毒方面［2］，部分研究发现，连翘提取物有较好的抗肿瘤活性［3］。2010年，我们首次从连翘中分离提取了DM，并发现其与紫杉醇、多西紫杉醇有明显协同效应［4］。三萜类化合物大部分由30个碳原子组成，可游离或以糖苷的形式存在，与糖结合的糖苷称为三萜皂苷。人参、甘草、三七、远志等中药中含有三萜类成分。三萜类化合物主要分为四环三萜、五环三萜，四环三萜的常见抗肿瘤机制为细胞毒作用、细胞周期阻滞、信号通路调控、逆转多药耐药、促进细胞分化和抑制肿瘤细胞转移等［5，6］。

本研究发现，DM 6．25 ～50．0 μg/ml能抑制PC-3细胞增殖，其随药物浓度增加和作用时间延长而增强，有明显的时效和量效关系。端粒酶是特殊的反转录酶，由RNA和蛋白质亚单位组成，能以自身RNA模板合成端粒DNA添加到染色体末端，避免染色体复制丢失端粒DNA使端粒延长，从而延长细胞寿命。我们发现DM作用PC-3细胞6 h后，肿瘤细胞端粒酶活性降低，48 h后其活性渐恢复至正常。提示DM有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

细胞周期紊乱及细胞周期调控因子分泌失衡是肿瘤细胞的典型特征。Cyclin D1是周期相关蛋白基因，其编码蛋白质可促进细胞增殖。p21基因编码的p21蛋白可抑制细胞增殖。CDC25A是癌基因，其过度表达可致细胞生长失控后恶性转化［7］。TGF-β介导的信号转导可促进靶蛋白泛素化，Smad3是此过程的限速因子。本研究表明，DM可使细胞周期相关基因p21、TGF-β、Smad3表达增加，Cyclin D1、CDC25A表达降低;提示DM可上调凋亡基因，抑制抗凋亡基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，具有对肿瘤细胞多部位、多靶点调控的特点，可能成为新的抗肿瘤中药的理想候选药物之一。

本研究发现，DM液25 μg/ml有较高的细胞凋亡率，故用该浓度作为放疗增敏浓度;结果显示，联合组用25 μg/ml DM液后，其放疗增敏作用提高，细胞存活下降，提示DM液对PC-3细胞具有放疗增敏作用。

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［5］Choi S，Kim TW，Singh SV．Ginsenoside Rh2-mediated G1phase cell cycle arrest in human breast cancer cells is caused by p15 Ink4B and p27 Kip1-dependent Inhibition of cyclin-dependent kinases［J］．Pharm Res，2009，26(10):2280-2288．

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［7］Draetta G，Eckstein J．Cdc25 protein phosphatases in cell proliferation［J］．Bioc Biop Acta，1997，1332(2):532-631．