CHFR及CHFR/PIK1途径与胃癌发生的关系

殷玉峰，王 慧，付金栋

(日照市人民医院，山东日照266800)

有丝分裂前期检查点(CHFR)是最近发现的1个新有丝分裂前期检查点基因，定位于染色体12q24．3，编码664个氨基酸的蛋白质。在细胞应激时，可以阻止染色体浓集，进入有丝分裂中前期。近年研究显示，CHFR在多种肿瘤组织中表达，其机制尚不完全明确［1］。本研究观察了CHFR在胃癌组织中的表达情况，且在细胞系中进一步验证此基因对肿瘤细胞增殖的影响，同时检测此作用有关信号通路中PIK1基因的表达。

1 资料与方法

1．1 临床资料 收集2005年7月～2006年6月于日照市人民医院胃镜室及普外科确诊为胃癌的患者64例，男44例、女20例，中位年龄58．3岁。患者术前皆未接受放、化疗。于患者癌组织及癌旁3 cm各取活检2～3块，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4 μm厚切片。

1．2 方法

1．2．1 免疫组化方法检测CHFR蛋白 以鼠抗人CHFR单克隆抗体(sc-13290，Snata Cruz公司)、PIK1 抗体(sc-98259，Snata Cruz公司)、CHFR siRNA(sc-37567)稀释浓度后染色，步骤按通用型抗人S-P免疫组化试剂盒(北京中杉公司)说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。鼠抗人CD31单克隆抗体(北京中杉公司)标记血管内皮，按文献［2］方法计数MVD。

1．2．2 Western blotting检测 CHFR蛋白 应用胃癌细胞系SGC7901/ADR为研究对象，细胞培养、传代参考文献［3］。细胞铺板:根据细胞系不同，参照Santa Cruz公司提供的转染试剂说明书进行。消化计数细胞后取1×105个细胞，用无双抗的完全培养基溶解细胞，取2 ml接种到6孔板中，在37℃、5%CO2孵箱中培养。采用MTT法检测细胞增殖情况。当细胞生长达到70%～80%融合时，进行转染。转染后提取细胞RNA对于干扰效率进行评价，取最佳时间点采用Western blotting检测下游基因PIK1的表达。提取组织蛋白;样品(蛋白)浓度的定量采用考马斯亮蓝法;蛋白质进行12%浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;硝酸纤维素滤膜，转膜2 h;与一抗室温下孵育2 h;辣根过氧化物酶标记的二抗(工作浓度1∶1 000)室温孵育1 h;免疫印迹化学发光试剂显示免疫反应条带;采用GEL-XR凝胶成像系统将电泳结果成像。

2 结果

2．1 胃癌及癌旁组织中CHFR蛋白的表达及MVD值 见表1。

2．2 CHFR与胃癌临床病理特征的关系 见表2。

2．3 胃癌中的CHFR蛋白的表达及与MVD关系CHFR阳性者MVD为(35．8 ±11．9)个/高倍视野、阴性者为(48．1 ±15．2)个/高倍视野。CHFR 高、低表达组织的MVD值比较有统计学差异(F=3．408，P ＜0．01)。

表1 胃癌及癌旁组织中CHFR的表达及MVD值

2．4 CHFR siRNA干扰后胃癌细胞增殖情况CHFR siRNA干扰后24 h细胞增殖效率即可达最佳状态。见图1。

表2 CHFR与胃癌临床病理特征的关系

图1 CHFR干扰不同时间段细胞增殖情况

2．5 PIK1蛋白的表达 细胞干扰24 h后下游信号通路PIK1蛋白的表达，见图2。

图2 CHFR干扰组与未干扰组PIK1蛋白的表达

3 讨论

CHFR最近被证明是一个有丝分裂早期稽查点基因，在G2/M过渡的早期发挥重要监控作用。在哺乳动物细胞中，它的激活可以分裂微管结构，通过延迟染色体凝集而阻滞细胞进入分裂中期，CHFR的表达可以增加细胞对有丝分裂的应激［4］。细胞学研究显示，在消化道肿瘤中，CHFR的表达缺失可能与甲基化有关。新近研究证实，CHFR是重要的肿瘤抑制基因，其表达产物是PIk1的泛素化连接酶。PIk1调控cdc25和Weel激酶的磷酸化，在G2期进入M期时控制cdc2激酶的活性。而CHFR能引起PIk1泛素化和降解，阻断细胞进入有丝分裂中前期，从而抑制肿瘤细胞生长增殖［5］。研究证明，CHFR在许多正常组织细胞中广泛表达，而在鼻咽癌、肺癌、食管癌、结肠癌等肿瘤中频繁失活。

本研究发现，CHFR主要表达在癌旁组织，提示CHFR表达下调或缺失参与了胃癌的发生、发展;同时研究发现CHFR表达与肿瘤的浸润深度明显负相关;胃癌的浸润深度与胃癌细胞的生长、增殖以及新生血管的形成有关。新生毛细血管的生成是实体肿瘤细胞生长、增殖的必要条件，也是肿瘤侵袭和转移的必要条件，肿瘤的应激状态可诱导与血管形成有关的多种细胞因子释放，促进肿瘤的生长和转移。本研究发现，胃癌组织中的MVD显著高于癌旁组织，且CHFR低表达与肿瘤血管形成的程度相关。提示CHFR表达缺失以及异常可能也参与肿瘤血管的形成。

既往研究提示CHFR的下调直接导致肿瘤发生，敲除CHFR或CHFR缺乏的鼠易患癌症。而在胃癌细胞试验中，我们同样观察到干扰CHFR表达后，细胞增殖速度在24 h开始明显增加，且有一定的上升趋势。同样在抑制CHFR表达后，其下游信号PIK1表达下降。研究提示，CHFR通过泛素化PIK12抑制 cyclin Bl进入细胞核、保持 Aurora A、Allrora B和cyclin Bl kdc2灭活及与p38应激激酶相互作用阻止细胞进入有丝分裂前期。本实验提示在胃癌发生中，CHFR/PIK1对于细胞的生长增殖有重要作用。

总之，本研究结果提示CHFR低表达促进了细胞周期，增强了细胞生长能力，与胃癌的发生发展密切相关;同时检测了胃癌组织中CHFR的表达状态以及下游信号通路，对全面了解胃癌发生中CHFR以及其信号通路表达有重要的指导价值。

［1］ Keller JA，Erson-Bensan AE，Petty EM．Connections between CHFR，the cell cycle，and chemosensitivity:are they critical in cancer［J］．Cancer Biol Ther，2010，10(9):942-944．

［2］Soritau O，Tomuleasa C，Aldea M，et al．Metformin plus temozolomide-based chemotherapy as adjuvant treatment for WHO gradeⅢand Ⅳ malignant gliomas［J］．J Buon，2011，16(2):282-289．

［3］Wei HL，Su HX，Bai DC，et al．Arsenic trioxide inhibits pglycoprotein expression in multidrug-resistant human leukemia cells that overexpress the MDR1 gene［J］．Chin Med J，2003，116(11):1644-1648．

［4］Keller JA，Petty EM．CHFR binds to and regulates MAD2 in the spindle checkpoint through its cysteine-rich domain［J］．Biochem Biophys Res Commun，2011，409(3):389-393．

［5］Takeshita M，Koga T，Takayama K，et al．Alternative efficacy-predicting markers for paclitaxel instead of CHFR in non-small-cell lung cancer［J］．Cancer Biol Ther，2010，10(9):933-941．