β防御素1基因-688G/C单核苷酸多态性与脓毒症的相关性

吴水晶，沈寅华，丁恩平，谢美月，马震俊，周 华

(浙江大学医学院附属第一医院，杭州310003)

β防御素1(DEFB1)是最早发现的一种β防御素，它具有较强的广谱抗菌活性，能够杀死G+和G－菌、真菌、包膜病毒等多种病原微生物，并且可以趋化未成熟树突状细胞和记忆性T细胞到局部炎症反应部位发挥效应，在固有免疫和获得性免疫中发挥重要作用。本文通过对脓毒症患者和对照者DEFB1基因启动子区域－688G/C单核苷酸多态位点进行基因型分析，探讨DEFB1基因启动子区域－688G/C单核苷酸多态性与脓毒症易感性和预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2005年1月～2007年8月我院ICU病房确诊为脓毒症患者211例(脓毒症组)，男123例、女 88例，年龄(60.6±17.5)岁;死亡 110例，存活101例。脓毒症诊断严格按照1992年和2001年美国胸科医师学会和危重医学会联席会议制定的脓毒症诊断标准，并排除孕妇及年龄小于18岁的患者。对照组为157例浙江大学医学院附属邵逸夫医院同期择期手术后未并发脓毒症患者，男96例、女61例，年龄(58.4±18.3)岁。两组性别、年龄有可比性。

1.2 方法 在获得患者知情同意后，抽取外周静脉血10 ml于EDTA抗凝管。每一个样本移取200 μl用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)严格按照说明书提取样本基因组 DNA。NCBI/Gene Bank网站获得DEFB1基因全长序列，premier 5.0引物设计软件设计PCR引物。引物序列如下:上游引物:5'-AGGTTAGGCAGTTCTGATGG-3';下游引物:5'-CCACTGAGACATCAGGAAAG-3'。引物扩增的PCR产物片段大小为547 bp，由上海生工生物技术工程技术服务公司合成。PCR反应体系为25 μl，包括:ddH2O 14.8 μl;10 × buffer 2.5 μl;dNTP(10 mmol/L)1.0 μl;上游引物(10 pmol/μl)1.0 μl;下游引物(10 pmol/μl)1.0 μl;MgCl2(25 mmol/L)2.5 μl;Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl;模板 DNA 2 μl。Mastercycler gradient PCR 仪(德国 Eppendorf公司)中进行扩增。扩增条件为:95℃ 3 min，95℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共35 个循环。利用Cac8I(New England BioLabs公司)对PCR产物进行酶切。酶切后产物片段大小为384 bp和163 bp。酶切体系为 20 μl，包括:ddH2O 14.75 μl;PCR产物 3 μl;10 × buffer 2.0 μl，;Cac8I(4 U/μl)0.25 μl。20 μl的酶切产物，经 1.8%的琼脂糖凝胶电泳和0.1%的溴化乙锭染色方法110 V电压电泳42 min观察分析DEFB1－688位点的基因型。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件，计数资料用百分比表示，组间基因型和等位基因频率比较采用χ2检验及Fisher's exact检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

脓毒症组和对照组DEFB1基因启动子区域－688位点基因型GG、GC、CC分布频率及等位基因G、C的频率比较均无统计学意义(P＞0.05)。脓毒症中死亡组与存活组基因型GG、GC、CC分布频率，等位基因G、C的频率比较均无统计学意义(P＞0.05)。见表1、2。

表1 脓毒症组和对照组DEFB1－688位点基因型和等位基因分布［例(%)］

表2 脓毒症中死亡组和存活组DEFB1－688位点基因型和等位基因分布［例(%)］

3 讨论

DEFB1基因在基因组中单拷贝，但存在多个单核苷酸多态位点(SNPs)，儿童HIV感染相关研究发现，DEFB1启动子区域－44CC基因型与母亲HIV感染以及胎儿感染 HIV 风险相关［1］;Milanese等［2］在对巴西东北人群中研究发现相似结果;Wallace等［3］研究表明，DEFB1 多态性(G→20A，C→44G，G→52A and Val38Ile)及其单倍型与吸烟患者肺部感染及其肺功能减退并无相关性;另外有研究表明，Val38Ile与日本人群患COPD相关，668C/G多态位点与中国人群COPD易感性相关［4］;本研究小组之前研究也发现，－44G/C单核苷酸多态性与重症脓毒症的易感性和预后存在相关性［5］。

本研究发现，DEFB1基因－688位点基因型分布和等位基因频率在脓毒症组和对照组以及脓毒症组中死亡组和存活组之间均无显著性差异，与脓毒症的易感性和预后无相关性，与Sun等［6］研究结果存在差别。我们分析引起这种结果差异的原因可能有两点:①DEFB1是一个肿瘤抑制因子，其高表达可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。因此，携带突变体等位基因C的人群由于其体内DEFB1水平相对低下，其患前列腺癌的风险相对增加。而DEFB1在脓毒症中的作用较复杂，它不仅可以直接杀灭病原微生物，而且可以通过调节免疫细胞发挥效应。②报告基因技术只是将DEFB1基因单独进行分析，并且Sun等［6］只是对转录起始点上游79～1 140 bp序列进行了研究。因此，DEFB1基因－688G/C多态位点相对比较独立，受其他多态性位点的影响小。本研究是在整个基因组中对DEFB1基因－688位点多态性进行基因型分析，DEFB1基因－688位点可能和其邻近位点的单核苷酸多态性存在连锁不平衡，影响 －688位点对DEFB1表达的调节作用和DEFB1在固有免疫系统中的功能。

影响脓毒症发生发展的因素很多。各种细胞因子水平影响脓毒症的发生和进展，防御素和细胞因子间也存在着广泛的联系，防御素基因也与邻近基因广泛交互影响。因此，将来运用高通量、快捷、先进的基因分型技术分析多个基因、多个位点的基因型，利用病例—对照关联分析和连锁不平衡分析方法可能更有利于探索遗传因素在脓毒症以及其他多基因疾病中的作用。

［1］Dommisch H，Acil Y，Dunsche A，et al.Differential gene expression of human beta-defensins(hBD-1，-2，-3)in inflammatory gingival diseases［J］.Oral Microbiol Immunol，2005，20(3):186-190.

［2］Milanese M，Segat L，Pontillo A，et al.DEFB1 gene polymorphisms and increased risk of HIV-1 infection in Brazilian children［J］.AIDS，2006，20(12):1673-1675.

［3］Wallace AM，He JQ，Burkett KM，et al.Contribution of alpha-and beta-defensins to lung function decline and infection in smokers:an association study［J］.Respir Res，2006，7(1):76.

［4］Matsushita I，Hasegawa K，Nakata K，et al.Genetic variants of human beta-defensin-1 and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，291(1):17-22.

［5］Chen QX，Lv C，Huang LX，et al.Genomic variations within DEFB1 are associated with the susceptibility to and the fatal outcome of severe sepsis in Chinese Han population［J］.Genes Immun，2007，8(5):439-443.

［6］Sun CQ，Arnold R，Fernandez-Golarz C，et al.Human beta-defensin-1，a potential chromosome 8p tumor suppressor:control of transcription and induction of apoptosis in renal cell carcinoma［J］.Cancer Res，2006，66(17):8542-8549.