奥硝唑缓释膜用于鼠类动物的生物安全性评价

徐全臣，陈秀娟，王志国，刘梦东，耿新杰

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003)

羧甲基壳聚糖(CM-C)是壳聚糖的水溶性衍生物，其可溶可吸收的特性作为成膜载体已经越来越受到人们的重视。研究显示，以CM-C为载体，奥硝唑为主药制成的缓释药膜，质量控制可靠，抑菌性和缓释性能良好［1，2］。为了保证该药膜用于人体时安全，2009年12月～2010年10月，我们按照国家规定，对药膜进行了生物安全性评价。

1 材料与方法

1．1 材料 实验动物为6周龄左右健康昆明小鼠10只，雌雄各半，体质量17～23 g，由青岛市药品检验所提供。白色豚鼠40只，体质量300～350 g，雌雄各半，由青岛市药检所实验动物中心提供。SPF级Wistar大鼠10只，雌雄各半，由山东大学医学院实验动物中心提供。实验细胞为V79细胞(中国仓鼠肺成纤维细胞)，由中国科学院上海生物科学院细胞资源中心提供。

1．2 方法

1．2．1 药膜的制备 取 CM-C 1．6 g，溶于40 ml纯化水中，配成4%的溶液;取高聚合物聚乙烯醇(PVA)1．6 g，溶于40 ml纯化水中，配成4%的PVA溶液。将两种溶液混合，加入甘油1 ml后搅拌4 h，加入0．48 g奥硝唑，继续搅拌4 h，然后把共混液倒入一底面光滑的圆形金属槽中。放入烘箱50℃烘干，12 h后取出即得药膜。所制药膜厚0．3 mm，可分切出任意大小形状。乙醇消毒后装入密封袋中保存。扫描电镜观察见药膜呈蜂窝状，孔隙均匀，直径约 3 μm 。

1．2．2 急性毒性实验 昆明小鼠10只，随机分为实验组和对照组，每组5只;实验组于尾静脉恒速注射载体浸提液50 ml/kg、对照组注射同批号灭菌生理盐水50 ml/kg，于注射后 4、24、48、72 h 观察动物有无轻、中、重度毒性反应或死亡情况。

1．2．3 细胞毒性实验 实验分3组:药膜浸提液组、阴性对照组(RPMI 1640培养液)、阳性对照组(0．1%苯酚)。将对数生长期的V79细胞用0．25%胰酶消化，制成1×104/ml的细胞悬液，取出96孔细胞培养板，分别加入细胞悬液100 μl，置37℃培养24 h。待细胞贴壁，弃去原培养液，分别加入各组材料(100 μl/孔)，同样条件继续培养 2、4、7 d 后，每孔加入 MTT 20 μl，再培养4 h，吸弃原培养液，每孔加入缓冲盐溶液150 μl，清洗2次，弃除余液，立即加入二甲基亚砜150 μl/孔，室温放置并轻度振荡15～20 min。使用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值(OD)，各组细胞按下式计算细胞相对增殖度(RGR)。RGr=实验组OD/阴性对照组OD×100%。

1．2．4 皮肤过敏实验［3］40只健康白色豚鼠随机平均分为4组:奥硝唑药膜组、基质组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(2，4-二硝基氯苯)。实验前24 h仔细将豚鼠背部两侧剪毛，面积约3 cm×3cm。分别用0．2 ml 125 g/L奥硝唑药膜浸提液、等体积基质浸提液、生理盐水、1%2，4-二硝基氯苯涂于豚鼠左侧脱毛区，用1层油纸及2层消毒纱布覆盖，以胶布固定，持续6 h;7 d和14 d以同样方法重复1次，共3次。于末次给药致敏后14 d，将受试物0．2 ml涂于豚鼠右侧脱毛区，其中阳性对照用0．1%2，4-二硝基氯苯，6 h后去掉受试物，温水冲洗干净，即刻观察并记录6、24、48 h皮肤及心率、呼吸等情况。根据出现的红斑与水肿情况评分计算反应值，最后计算出实验动物皮肤致敏率结果。

1．2．5 体内降解实验 10只Wistar大鼠，背部剪毛形成约4 cm×4 cm的术野，沿脊柱作一长约2 cm的切口，取脊柱两侧等距离的两个肌肉位点，用止血钳分离脊柱两侧肌肉，形成足够间隙。奥硝唑药膜剪成4．0 mm×8．0 mm长方形，烘致恒重，经紫外线消毒，植入大鼠背部肌肉。1、2、4、6周切取标本，洗去黏附物，烘致恒重，按下式计算降解百分率。降解百分率=(W0-W1)/W0×100%;W0为降解前质量(g)，W1为降解后质量(g)。

2 结果

2．1 急性毒性实验 实验组和对照组小鼠状况良好，未见明显毒性症状，72 h内活动如常，饮食饮水均正常，无动物死亡现象，动物体质量日益增加。

2．2 细胞毒性实验 药膜浸提夜组毒性分级为0～Ⅰ级，说明药膜对细胞无不良反应，符合国家规定的标准。见表1。

表1 各组在不同培养时间的OD值、RGR及细胞毒性分级

2．3 皮肤过敏实验 实验组观察6、24、48 h，皮肤过敏实验致敏率均为0，阳性对照组分别为90%、100%、100%。

2．4 体内降解实验 1周时实验组内置膜取出后基本完整，表面粗糙，有白色及红色絮状附着物。第2周时，内置膜已成凝胶状，较第1周明显变薄，与周围组织易区分。第4～6周呈菲薄致密近透明的银白色纤维囊，周围组织颜色正常。1、2、4、6周奥硝唑药膜降解百分率分别为15%、35%、72%、98%。

3 讨论

生物材料在应用于人体之前必须经过严格的检验，除临床应用所要求的机械及理化性外，还应具有良好的生物安全性。CM-C是壳聚糖的水溶性衍生物，具有良好的生物相容性以及可降解性［4］。本实验中，奥硝唑缓释药膜无全身急性毒性及皮肤过敏性，埋植于大鼠肌肉后2周时已经融化，6周时几乎完全降解，龈沟中的液体量多于肌肉组织，推测药膜在3周左右即可完全降解。

以CM-C为载体的缓释药膜质地均匀，在电镜下观察，材料表面呈蜂窝状，纵剖面上有较规则的通道，这些孔和通道相互构成网架，形成三维立体结构，适合细胞的三维生长，能为新生组织提供良好的支架。在细胞毒性实验中，实验组细胞在第4天和第7天的细胞相对增殖率大于100%，表现出对细胞生长的促进作用，这种促进作用与文献报道的CM-C能够促进成纤维细胞的生长的结论相一致［5］。基于以上两点我们推测，将缓释药膜置于牙周袋内，能够促进牙周膜成纤维细胞的再生。

综上所述，以CM-C为载体，奥硝唑为主药制成的缓释药膜具有良好的生物安全性，可望应用于临床。

［1］徐全臣，钟德钰，吉秋霞，等．奥硝唑缓释膜体内外释放度的研究［J］．中国药房，2007，18(1):33．

［2］徐全臣，王志国，邓婧，等．奥硝唑缓释膜生物学性能的初步研究［J］．中国海洋药物，2009，28(6):36．

［3］孙敬方．动物实验方法学［M］．北京:人民卫生出版社，2001:195-375．

［4］Wang LC，Chen XG，Xu QC，et al．Plasma protein adsorption pattern and tissue-implant reaction of poly(vinyl alcohol)/carboxymethyl-chitosan blend films［J］．J Biomater Sci Polym Ed，2008，19(1):113．

［5］王征，刘万顺，韩宝芹，等．不同分子量羧甲基壳聚糖的制备及其对皮肤成纤维细胞和角质形成细胞生长的影响［J］．生物医学工程学杂志，2007，24(2):340．