润通舒对烫伤大鼠肠黏膜屏障功能的保护作用研究*

喻正科 陈立峰 颜 旭 王银山 李勇敏 周 兵 何亚辉

湖南省中医药研究院（湖南长沙410006）

机体在严重烫伤等应激状态下，肠道黏膜屏障功能削弱或损害，肠道内的细菌、内毒素易位进入血液循环，并在一定条件下激发细胞因子的连锁反应和毒性网络，引起全身炎症反应，导致中毒性肠麻痹，最终可引起多器官功能障碍综合征（MODS），甚至多器官功能衰竭（MOF）。上述一系列情况发生发展的关键之一，是肠黏膜屏障包括机械屏障、生物屏障、免疫屏障功能损害。笔者以往的研究[1]发现依据滋阴活血润肠法组方的润通舒可减少烫伤大鼠肿瘤坏死因子的产生，抑制肠组织细胞凋亡。本实验旨在过去研究基础上，进一步探讨本方对烫伤大鼠肠道黏膜菌群的影响和提高免疫功能的作用。

1 材料与方法

1.1 药物制备 润通舒由生地黄、玄参、当归等8味药物组成，由湖南省中医药研究院研制。上述药物按 《中华人民共和国药典》规格采购，按要求制成超微颗粒再压成片剂，每片含生药0.6g。取上述片剂置乳钵中研磨，用蒸馏水配制成50mg/mL质量浓度的混悬液。

1.2 分组及造模 SD大鼠70只，雌雄各半，体质量180～220g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。根据文献[2]制作模型。动物禁食（不禁水）过夜，动物腹腔内注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后，背部用20%硫化钠脱毛约10cm×6cm，将背部浸入沸水中12s，造成背部8cm×4.5cmⅢ°烫伤（经病理切片证实）。伤后1h，腹部皮下注射生理盐水50mL/kg抗休克，创面涂20%磺胺嘧啶银糊剂，单笼喂养，自由进食水。将大鼠随机分成治疗组（n=30），对照组（n=30），正常组（n=10）。 治疗组给润通舒 50mg/kg，每日分2次灌胃，对照组予生理盐水（1mL/100g）灌胃，两组分别在烫伤后第1日，第3日、第7日取10只麻醉，无菌操作下剖腹并行主动脉穿刺抽血处死，正常组不处理，直接处死进行检测。

1.3 血浆内毒素测定 凡与鲎试剂接触物件均须灭菌和去热源处理。无菌条件下抽血1mL，肝素抗凝，500r/min离心5min，取血浆0.1mL，加入无热源生理盐水0.2mL、Tris-HCl缓冲液0.2mL混匀，置于100℃水浴加热10min，3000r/min，取上清检测。检测用鲎试验偶氮显色法，鲎试剂盒由RDEzymelinked Immunosorbent Assay提供。

1.4 肠黏液SIgA测定 剪取空回肠中段约20cm，再分成3～4段，纵行剖开，轻轻刮除肠腔内粪便等，用玻片刮取肠黏液，收集于EP管中，加入0.01mol/L PBS，混匀后3000r/min离心10min，取上清，采用双抗夹心放免法测定。严格按说明书操作，同时取上清用双缩脲法测定总蛋白，由上述结果计算每毫克肠黏液蛋白中SIgA的微克数。

1.5 回盲部黏膜菌群检测 剪取靠回盲部末端2.5cm盲肠，纵行剖开，轻轻清除内容物，用0.01mol/L PBS漂洗3次，无菌滤纸吸干，称质量，10000r/min离心匀浆，10倍系列稀释匀浆液。取100μL，分别接种于各种选择培养基，需氧培养（37℃）24h，真菌和厌氧菌培养48h计数并鉴定。

1.6 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件。计量资料进行t检验和方差分析，各项指标以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血浆内毒素水平的改变 见表1。与正常组比较，对照组大鼠伤后1、3d及治疗组1d血浆内毒素含量明显增加（P＜0.05或0.01）；1d、3d时治疗组血浆内毒素含量均低于对照组 （P＜0.05），而 3、7d 时接近正常组。

2.2 小肠黏液SIgA质量浓度变化 见表1。与正常组比较，对照组大鼠伤后小肠黏液SIgA质量浓度持续减少 （P＜0.05或0.01），以 1、3d明显；治疗组与正常组比较伤后 1d亦减少（P＜0.05），但3、7d明显恢复，差异无统计学意义。

2.3 回盲部黏膜菌群的变化 见表2。与正常组比较，对照组大鼠伤后黏膜菌群中双歧杆菌量均明显减少，治疗组伤后1d双歧杆菌量较正常组亦明显降低，其后则变化较大，伤后3、7d与正常组相比较，差异无统计学意义，与对照组相比较，显著增加。与正常组相比较，对照组大鼠伤后1d、3d黏膜菌群中大肠埃希菌量均明显增加；治疗组大鼠伤后3d、7d均明显减少，与对照组相比较，治疗组大鼠伤后1d、3d、7d均显著降低。与正常组相比较，对照组大鼠伤后黏膜菌群中真菌量均明显增加，以伤后1d、3d最多；治疗组未见真菌量增加，且明显低于对照组。

表1 各组大鼠小肠黏液SIgA、血浆内毒素水平比较 （±s）

表1 各组大鼠小肠黏液SIgA、血浆内毒素水平比较 （±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组同期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n 黏液SIgA（μg/mg）内毒素（EU/mL）0.0698±0.0476 1d 10 61.32±13.23** 0.2413±0.1476**对照组 3d 10 51.36±18.45** 0.1889±0.1563*7d 10 66.53±19.42* 0.1139±0.0913 1d 10 69.96±17.32* 0.1304±0.0819*△治疗组 3d 10 73.61±12.14△ 0.0968±0.0463△7d 10 84.76±16.23△ 0.0813±0.0395正常组 10 88.13±16.81

表2 各组大鼠回盲部黏膜菌群的变化 （lgCFU/g，±s）

表2 各组大鼠回盲部黏膜菌群的变化 （lgCFU/g，±s）

组 别 n 双歧杆菌正常组 10 7.62±0.73真菌2.13±0.81 5.62±1.13**对照组 3d 10 6.04±0.42** 5.45±1.56** 3.76±0.56**7d 10 6.16±0.54** 4.21±0.97 2.97±0.95*1d 10 6.33±0.94* 3.86±1.34△△ 2.61±0.84△△治疗组 3d 10 7.45±0.63△△ 1.63±0.86**△△ 2.54±1.13△△7d 10 7.56±0.82△△ 2.34±0.95**△△ 1.96±0.75△大肠埃希菌4.13±0.82 1d 10 6.11±0.83** 3.65±0.75**

3 讨 论

烫伤后，由于创伤而处于应激状态，往往破坏肠上皮细胞间的紧密连接，导致肠黏膜屏障功能受到损害，其通透性升高，从而使肠道蓄积的内毒素得以侵入体内，形成内毒素血症[3]。动物实验结果表明：大鼠伤后1、3d对照组血浆内毒素明显高于正常组，润通舒灌胃后，大鼠伤后1d血浆内毒素含量即明显降低，3、7d接近于正常组，提示本方可明显降低内毒素的入侵。

肠道局部免疫功能在烫伤时肠源性感染的发生中起重要的保护作用，肠黏膜表面黏液层具有重要的生理屏障功能。黏液中的糖蛋白和SIgA相互配合，将SIgA包绕的细菌牢固地限于黏液层中，并随黏液层的更新和流动将包绕的有害菌排除体外[4]。本实验结果显示，严重烫伤后，肠黏液SIgA分泌明显受抑，而伤后大鼠予润通舒灌胃后3、7d SIgA质量浓度接近于正常水平，提示该方可增加肠道SIgA的合成与分泌，从而改善肠道局部免疫功能。

正常情况下，肠道菌群通过与肠黏膜附着结合形成生物屏障，一方面与宿主保持共生关系，提供营养成分或参与免疫系统的构建；另一方面，使机体免受潜在致病菌的侵袭。在某些情况下，如严重烧创伤、大手术等，肠道生物屏障遭到破坏，肠内菌群紊乱，导致细菌或内毒素移位，进一步加重病情[5]。肠道生物屏障99%由厌氧菌组成，而双歧杆菌所占比例最大，在维护肠道生物屏障方面居主导地位。它既可有效抑制G-肠杆菌等优势移位菌的过度增殖，又能够刺激肠道局部免疫功能，使SIgA合成和分泌增加，从而发挥其保护生物屏障的作用。本实验中，笔者观察到烫伤后回盲部黏膜菌群改变显著，表现为双歧杆菌量明显减少，大肠埃希菌和真菌量成倍增加。但伤后予润通舒灌胃，在短时间内双歧杆菌量即明显增加，大肠埃希菌和真菌量显著减少，表明该方可改善肠道菌群的平衡失调。

机体在遭受严重创伤、烫伤时损血失津，致阴亏津少，则血行涩滞，血脉瘀阻，反过来又影响津血之化生，如此则肠失濡润，从而导致肠道传输失司，大便燥结，糟粕内停，粪毒滞留，热随毒生，反过来进一步损血耗津，内伤脏腑，甚至导致脏腑功能衰竭。润通舒依据中医“六腑以通为用”的理论，提出了滋阴活血润肠治则，滋阴以助津液，津液输布，肠道得以濡润，传导功能才得以恢复；活血以改善肠道微循环，降低血管阻力，缓解肠黏膜缺血、缺氧程度；润肠以防治肠麻痹，保证肠道能及时有效地排除浊质或浊气，做到治本清源的目的。

[1]郑爱华，蔡光先，王银山，等.滋阴活血润肠法对烫伤大鼠肠黏膜屏障的影响[J].实用中西医结合临床，2008，8（1）：2.

[2]王忠堂，姚咏明，肖光夏，等.双歧杆菌对烫伤大鼠肠道黏膜机械及生物屏障的改善作用[J].中国危重病急救医学，2003，15（3）：155.

[3]张雅萍，王忠堂.B.B.R对严重烧伤大鼠肠道屏障功能的保护作用[J].中国微生态学杂志，2002，14（5）：250.

[4]张雅萍，史政荣.益生菌对烧伤大鼠肠道膜菌群和SIgA的影响[J]中国微生态学杂志，2004，16（5）： 259.

[5]王忠堂，肖光夏，肖杰，等.双歧杆菌悬液对严重烧伤患者美罗培南用后肠菌群紊乱的扶正作用 [J].中华烧伤杂志，2002，18（3）：111-112.