吸入一氧化氮对急性大面积肺血栓栓塞家兔血浆vWF、GPⅡb/Ⅲa和CTnI的影响

张泽明,陈宝元,葛常青,张敬国,王彦存,赵学琴

(1.天津医科大学总医院 呼吸科,天津300402;2.保定市第二医院;3.河北大学附属医院 呼吸科)

急性大面积肺血栓栓塞早期死亡率达45%-90%,特别是伴有并发症患者如休克和心力衰竭的肺血栓栓塞症病死率更高[1]。肺栓塞患者心室功能障碍的原因不是十分清楚,但肺血栓患者合并有心力衰竭时,多同时伴有血浆心肌肌钙蛋白的升高和心肌受损[2],且与临床预后呈明显负相关[3]。吸入一氧化氮能明显保护心肌受损,改善临床预后[3],目的是进一步探讨吸入一氧化氮对急性大面积肺血栓患者心肌受损保护作用机理,我们实验大面积肺栓塞症家兔动物模型,研究心肌受损时,血浆心肌肌钙蛋白、血浆血管性假血友病因子(vWF)和血小板膜表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)的改变,及了解吸入一氧化氮对其影响,现报告如下:

1 材料和方法

1.1 材料

日本大耳白兔30只,体重2-2.8 kg,兔龄6-10个月,雌雄不限,由河北省实验动物中心提供,随机分为三组,实验组:大面积肺血栓栓塞症动物模型组;对照组:本组动物模型制作只静脉注射生理盐水,不注射血栓栓子:治疗组:大面积肺血栓栓塞症动物模型后2小时吸入一氧化氮治疗。每组家兔10只。

1.2 急性大面积肺栓塞症家兔受损害心肌动物模型的制备

在局部消毒后,经耳缘静脉注入乌拉坦溶液(20%)麻醉剂,注入剂量1.0 g/kg,为保护气道以利于自主呼吸行气管插管,成功麻醉后,常规胸前大约2 cm的横切口,同时行机械通气,然后分离左颈外动脉和右颈静脉,以及暴露并分离清楚左侧股静脉,分别自右颈动脉和左颈静脉插入微动脉导管和自制的肺动脉导管,示波器监视肺动脉导管插管全过程,依据导管插入的长度和示波器显示的压力波形综合判断肺动脉导管头端的位置。实验过程中用微量蠕动泵经肺动脉导管间断恒流输入生理盐水0.3 ml/min。经三通管通过压力传感器将两导管连接多道生理参数分析记录仪,同步控制肺动脉压和动脉平均压,分离并穿刺左股静脉插入微导管,随时采血和补液应用,血栓栓子制备好后装入注射器中(5 ml),经右测颈静脉的肺动脉导管反复注入家兔血流中,栓子注入每次0.5 ml,用生理盐水2ml快速注入,每隔3分钟注入一次,血栓栓子连续推注至家兔动脉平均血压下降至基础测量值的40%,家兔低血压状态大约维持在55-60 mmHg,维持此状态约40分钟,如此认定家兔肺血栓达到大面积肺血栓栓塞的程度,此时栓子注入停止。制备模型过程中,家兔如有明显呼吸困难,则应进行短暂呼吸机机械通气治疗,采用28次/分呼吸频率,压力控制20 cm水柱压力。对照组家兔动物模型制作只静脉注射生理盐水,不注射血栓栓子;治疗组在急性大面积肺栓塞动物模型成功制备后2小时开始吸入一氧化氮。三组家兔同时行机械通气,机械通气吸入50%氧浓度。

1.3 一氧化氮吸入方法

试验家兔自平均动脉压达到基础血压的40%或出现、气短、发憋呼吸困难症状亦即家兔肺栓塞成功后2小时后开始机械通气,一氧化氮由N2和800×10-6g/L一氧化氮混合气体减压后和空气及氧气混合,吸入一氧化氮浓度为40×10-6g/L,距离气管插管处1m的距离接入呼吸机管道,行有创机械通气治疗,压力控制通气模式进行通气,控制呼吸频率在28次/分,压力控制在20 cm水柱以内,呼吸机行机械通气治疗时兔吸入50%氧浓度,应用氮氧化合物分析仪持续监测NO2、NO浓度,试验整个过程高铁血红蛋白浓度被监测,其水平＜0.3 g/L。

1.4 采血方法

三组动物试验前气管插管,肺血栓栓塞成功后,即动脉平均压达到基础血压的40%,此状态持续大约40分钟,在插管前、动物模型成功后2小时、吸入一氧化氮后24小时开始抽血,同时监测动脉平均压和平均肺动脉压。

1.5 血浆血管性假血友病因子(vWF)和血浆心肌肌钙蛋白、血小板膜表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)的测定

用仪器公司全自动免疫分析仪(美国),微粒子化学发光法测定血浆心肌肌钙蛋白的浓度,美国贝克曼公司提供试剂盒,GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体为美国BectonDic kinson公司产品,美国BectonDic kinson公司生产的流式细胞仪检测血小板膜上GPⅡb/Ⅲa,血浆血管性假血友病因子(vWF)试剂盒购于上海太阳生物技术公司,方法严格按说明书操作。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 急性大面积肺血栓栓塞症心肌受损动物模型

血浆心肌肌钙蛋白浓度于2小时开始增高,于24小时后明显高于对照组(P＜0.05),吸入一氧化氮24小时后其浓度水平明显下降与实验组比较(P＜0.05)。

急性大面积肺血栓栓塞症家兔血栓栓塞后2小时和24小时其血浆vWF、GPⅡb/Ⅲa水平明显高于对照组(P＜0.05),吸入一氧化氮24小时后其浓度水平明显下降与实验组比较(P＜0.05)。见表1。

表1 三组动物血浆VWF(%)、GPⅡb/Ⅲa(%)和 CTnI(μ g/L)比较及吸入NO对其影响(s)

表1 三组动物血浆VWF(%)、GPⅡb/Ⅲa(%)和 CTnI(μ g/L)比较及吸入NO对其影响(s)

△与对照组T24比较,VWF、GPⅡb/Ⅲa、CTnI其 q值和P的情况为:q值8.31、9.80、14.79 P＜0.05;V#与对照组T2比较,VWF、GPⅡb/Ⅲa、CTnI其q值和P的情况为:q值 3.75、6.20、2.01 P＜0.05;V*与试验组T24比较,VWF、GPⅡb/Ⅲa、CTnI其q值和P的情况为:q值6.71、4.09、3.19 P ＜0.05

观察指标 例数(n)对照组 试验组 治疗组T2 T24T2 T24T2 T24 VWF(%)10 111.2±24.6 113.1±25.1 153.8±26.2#212.7±28.4△ 151.9±25.1131.8±25.4*GPⅡb/Ⅲa(%)10 2.14±0.82 2.13±0.79 14.04±6.01#23.03±6.70△ 14.15±6.40 10.4±7.1*CTnI(μ g/L)10 0.092±0.02 0.08±0.009 0.110±0.02#0.41±0.07△ 0.112±0.02 0.31±0.07*

2.2 实验组模型制备成功后24小时血浆心肌肌钙蛋白与血浆vWF、GPⅡb/Ⅲa相关性分析

试验组模型制备成功后24小时血浆心肌肌钙蛋白与血浆vWF1明显正相关性(r=0.99,P＜0.01);血浆心肌肌钙蛋白与GPⅡb/Ⅲa亦呈明显正相关性(r=0.99,P＜0.01)。

2.3 治疗组吸入一氧化氮24小时后血浆心肌肌钙蛋白与血浆vWF、GPⅡb/Ⅲa相关性分析

治疗组吸入一氧化氮24小时后血浆心肌肌钙蛋白与血浆vWF明显正相关性(r=0.98,P＜0.01);血浆心肌肌钙蛋白与GPⅡb/Ⅲa亦呈明显正相关性(r=0.98,P＜0.01)。

3 讨论

本研究结果亦显示家兔在发生大面积肺血栓栓塞后其血浆vWF和血小板膜表面蛋白GPⅡb/Ⅲa复合体增加,明显高于对照组,且与心肌肌钙蛋白呈明显的正相关,而心肌肌钙蛋白是肺血栓栓塞症心肌受损的主要指标[8],说明血浆vWF和血小板膜表面蛋白GPⅡb/Ⅲa复合体增加在肺血栓栓塞症家兔心肌受损过程中起着重要的作用,分析其原因:大面积肺血栓栓塞家兔,栓子在肺血管内运动,导致血管内皮受损,使vWF大量分泌于血浆中。大量增加的vWF在肺血栓栓塞发生发展过程中存在两个主要生理作用:①调节血小板黏附和聚集,阻止血栓的形成;②携带并稳定血浆Ⅷ因子的活性。在正常状态下,血小板以无活性形式通过肺循环,且很少表现出与肺微循环的相互作用。当肺栓塞发生后,肺血管的内皮细胞受损伤,血浆血小板直接或通过vWF血浆蛋白介导迅速黏附到因受损血管所暴露的内皮下成分上,且在此处迅速被激活,激活的血小板表达和释放出大量血管活性物质。P选择素具有介导内皮细胞或血小板活化与不同类型细胞相互黏附的功能,是目前所知的映血小板活化与释放反应最特异的标志物,在启动和扩增血栓形成中具有重要意义[6],血小板活化释放的血栓素A2(TXA2)是在氧化酶作用下由花生四烯酸转化而来的重要的肺血管活性介质和前列腺素(PGI2)是血浆中一对保持平衡的血管活性物质。同时大面积肺血栓栓塞导致家兔血浆中vWF明显升高和缺血缺氧损害冠脉内皮细胞,这些全身和局部因素共同作用使家兔活化血小板明显增强,同时冠脉内皮细胞受损,使NO和前列腺素(PGI2)分泌减少,TXA2分泌增加,从而使冠脉血管收缩增强,舒张减弱,这些体液因子的改变加上血小板活化使冠脉血管血栓形成,导致心肌缺血缺氧,从而使心肌受损坏死,血浆心肌肌钙蛋白升高,但肺血栓栓塞后因vWF分泌增加导致的TXA2等血管收缩物质的分泌增加及TXA2/PGI2的平衡失调导致的肺动脉高压亦可能是心肌受损的一个原因[9]。

本研究显示吸入一氧化氮能明显降低大面积肺血栓栓塞症家兔vWF水平和血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的表达以及心肌肌钙蛋白的浓度,且呈明显的相关性,其可能的机理为NO为抑制血管内皮细胞上GMP-140的表达,减轻中性粒细胞和内皮细胞的粘附,保护血管内皮细胞受损[10],从而降低肺血栓栓塞症家兔vWF水平,家兔vWF水平抑制血小板聚集和活化,抑制血栓发生和发展。NO可能是通过抑制蛋白酶C(PKC)活性来抑制血小板的活化,从而下调血小板GMP-140的表达[11]。NO激活血小板内可溶性鸟苷酸环化酶,引起血小板内的环磷酸鸟苷迅速增加,使血小板内Ca2+浓度降低,抑制纤维蛋白原与血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体结合,从而降低血小板聚集功能和GMP-140的表达[12],同时本研究发现吸入NO可以直接降低血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体。因此吸入NO降低vWF水平和血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体,抑制血小板聚集功能阻断血栓栓塞的多个发病环节,减轻肺血栓栓塞患者的心肌受损,降低血浆心肌肌钙蛋白的浓度。

吸入一氧化氮降低大面积肺血栓栓塞症家兔vWF水平和血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体,可能是导致吸入一氧化氮降低大面积肺血栓栓塞症家兔心肌肌钙蛋白的浓度水平的原因。

总之,大面积肺血栓栓塞症时血浆vWF、血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa明显升高,且与心肌受损呈明显正相关,吸入NO降低其vWF、血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa水平,是保护大面积肺血栓栓塞症心肌受损的主要机理之一。

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